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[ Scientific Activities - Actividades Científicas ]

Investigación Biotecnológica en la Enfermedad de Chagas y su aplicación al control de la transmisión

Andrés Mariano Ruiz y Elsa Leonor Segura

Instituto Nacional de Parasitología Dr Mario Fatala Chaben
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud Dr. Carlos G. Malbran
Argentina

La disminución de la prevalencia de la Enfermedad de Chagas y de la aparición de casos agudos señalan que en la Argentina y en otros paises del Continente, es factible el control de la transmisión del T cruzi especialmente cuando la comunidad, a través de los efectores de Atención Primaria de la Salud (APS) participa en los programas de control. Las investigaciones de laboratorio han jugado un importante papel conjuntamente con las acciones de campo para los logros de esta situación actual. Desde el desarrollo y estandarización de los métodos de diagnóstico, su transferencia para el control de los bancos de sangre hasta el tratamiento de los infectados y enfermos han sido las investigaciones biotecnológicas un fuerte soporte a todo el sistema de salud y a los progamas de control. Las nuevas tecnologías han proporcionado un fuerte impulso a estas investigaciones del laboratorio reforzando la necesidad de su presencia en la prevención, control y cura de las enfermedades. Se describen en este articulo aportes que nuestro laboratorio ha realizado desde el laboratorio al control de la enfermedad de Chagas, como el desarrollo de un ensayo inmunoenzimático para el diagnóstico serológico y de otro capaz de evaluar la efficencia del tratamiento antiparasitario en niños. Se describe también los avances realizados por nuestro grupo en el estudio del Genoma del parásito.

Estandarización de un kit confirmación (FATALAKIT) para el inmunodiagnóstico de la infección por el T. cruzi

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El diagnóstico de la infección por el T. cruzi constituye un elemento importante para el control de la transmisión y atención del paciente con Enfermedad de Chagas. Desde el punto de vista de los antígenos, se han realizado muchos estudios y definido muchas moléculas y preparaciones que han contribuido a su mejoramiento. Se describe aqui el desarrollo de un kit de confirmación del inmunodiagnóstico. El FATALAKIT IEE es un, ensayo inmunoenzimático en microplaca constituido por dos diferentes antígenos que se analizan independientemente. Un antígeno soluble (PS) purificado por centrifugación diferencial a partir de homogenato total de epimastigotes y un antígeno (Ag4) purificado por inmunoafinidad mediante el anticuerpo monocional FCH-F8-4 (Ruiz y col. Mol. Bioch. Parasitol;30:115-124,1990). El Kit fue calibrado determinando para ambos reactivos las características y condiciones óptimas de absorción a la fase sólida, diluciones de los sueros y conjugado (peroxidasa anti lgG humana) y tiempos de incubación. El FATALAKIT fue evaluado con dos paneles diferentes de sueros, uno de ellos integrado por muestras de 124 pacientes seleccionados clínica y parasitológicamente y otro con 1083 sueros de individuos provenientes de un área endémica de Salta seleccionados por dos técnicas serológicas ya estandarizadas (inmunofiuorescencia y hemagluti-nación). La evaluación del primer lote mostró un 100% de sensibilidad (24/24 sueros de pacientes con Enfermedad de Chagas) y 99% de especificidad (99/100 individuos normales). Resultados similares fueron obtenidos con los sueros provenientes de Salta (823/827 sueros confirmados y 254/256 sueros no reactivos). índice kappa = 0.98. Estos resultados muestran al FATALAKIT como un test de alta especificidad y sensibilidad y promisorio para su transferencia al sector productivo. (Figura 1)

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Desarrollo de un ensayo inmunoenzimatico para la evaluacion del tratamiento de la Enfermedad de Chagas.

.La evaluación de la eficacia del tratamiento terapeútico en la Enfermedad de Chagas crónica es generalmente encarado mediante la busqueda en sangre Periférica del T. cruzi o sus componentes, ya que la desaparicion sostenida del parásito es un inequívoco criterio de cura. La serología convencional es de utilidad relativa, ya que permanece reactiva por largos periodos después de realizado el tratamiento en nuestra experiencia en Argentina. En este trabajo se describe el desarrollo de un ensayo inmunoenzimático, usando como antígeno una proteína flagelar recombinante de T. cruzi (F29) y su aplicación para evaluar la cura de pacientes sometidos al tratamiento con benznidazol. El clon codificante de la proteína total fue identificado y caracterizado a partir del rastreo inmunológico de una biblioteca de expresión construida en lgt11, usando un suero de conejo anti fracción flagelar. Este cion fue subclonado en el vector de expresion pMAL-p2 y expresado en Escherichia coli. Esta proteína está altamente conservada en trypanosomatidos, no se encuentra en Leishmania y es capaz de ligar el ion calcio, pudiendo estar involucrada en la penetración del parásito a la célula. El ensayo inmunoenzimático se llevo a cabo sensibilizando placas de 96 orificios con 50 µl/pocillo de la proteína fusionada a MBP (proteína ligadora de maltosa) (20 µg/mi). Ciento seis niños infectados entre seis y 12 años de edad (55 tratados con benznidazol 5 mg/kg/día y 51 placebo) fueron estudiados mediante este ensayo. Se tomaron muestras de suero a los 3, 6, 12, 18, 24 y 48 meses después del tratamiento. Esta evaluación mostró que el 35.7% de los chicos tratados negativizó la reactividad hacia F29 a los 6 meses post-tratamiento y un 62.1 % a los 48 meses, mientras la serología convencional permaneció reactiva en todos los casos. La cinética de desaparición de la reactividad hacia el antígeno también fue estudiada por inmunoblotting. Los resultados indican que F29 podría constituir un marcador temprano de desaparición de la infección, de utilidad para la evaluación de cura terapeútica. (Figura 2)

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Genoma del T. cruzi

El proyecto Genoma del T. cruzi fue una iniciativa de la Organización Mundial de la Salud, TDR (Special Programme for Research in Tropical Diseases) cuyo objetivo es la secuenciación completa del genoma del parásito permitiendo el conocimiento de la estructura de las moléculas involucradas en la infección y así identificar posibles blancos de ataque para su destrucción, a través de una quimioterapia y/o una inmunoprofilaxis efectiva. Los laboratorios que intervienen en este emprendimiento conjunto son 20; tres de los cuales pertenecen a Argentina, 9 a Brasil y Venezuela, y 1 a E.E.U.U. En Europa se encuentran involucrados 7 laboratorios, en Alemania, España, Francia, Reino Unido y Suecia. Se establecieron redes de trabajo en las que se ha cumplido una fundamental tarea de generar bibliotecas genómicas de grandes fragmentos de ADN, otras de ADN copia y distribuir el material entre los laboratorios interesados. La amplia heterogeneidad del T. cruzi en cuanto a sus propiedades biológicas motivó la elección de un único organismo de estudio y referencia para toda la red involucrada en el estudio el genoma. El cion elegido fue CL Brener, deriva de la cepa CL, aislada de un Triatoma infestans. Esta cion presenta las características más representativas del parásito. Nuestro laboratorio participa en este proyecto con la caracterización del cariotipo molecular a través de marcadores cromosomales y con el mapeo físico y transcripcional del genoma completo del parásito.

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Caracterización del cariotipo molecular a través de marcadores cromosomales

Debido a que el material genético del T. cruzi se organiza en cromosomas pequeños que no condensan durante la división celular, su estudio por técnicas convencionales en citogenética no es posible, pero sí lo es mediante la separación del genoma en bandas cromosomales por electroforesis en campo pulsado. El tamaño del genoma y número de bandas cromosomales varía de una cepa a otra del T. cruzi. Al comienzo de este proyecto, se estimo en 55 megabases el tamaño del genoma del T. cruzi, pero estimaciones más recientes aproximan el genoma a un tamaño entre 80 y 100 Mb. Para el análisis y visualización de diferentes rangos de bandas cromosomales se deben utilizar diferentes condiciones de separación para resolver apropiadamente la separación de los cromosomas más pequeños, intermedios y los de mayor tamaño. En un estudio en que se ensayaron 13 condiciones de separación de cromosomas se encontraron diferentes patrones de migración de bandas cromosomales entre los ciones CL Brener, CA-I/72 y Sylvio Xl 0/7, siendo los cromosomas de CL Brener más grandes en general que en los otros ciones estudiados. El número de cromosomas estimados es de al menos 64, la mayoría de estos representados como cromosomas homólogos. Cuando estas electroforesis en campo pulsado fueron transferidas a filtros de nylon y se analizaron mediante hibridación con 35 marcadores específicos, se observó que 30 de ellos reconocieron cromosomas únicos. Las sondas específicas para cromosomas identificaron entre 26 y 31 bandas cromosómicas en los tres clones estudiados, correspondiendo a 20 cromosomas únicos en CL Brener y 19 en CA-I/72 y Sylvio XlO/7. Algunos marcadores mostraron grupos de connección entre sí y se identificaron 9 diferentes grupos conectados, cada uno comprendiendo de 2 a 4 marcadores. Este estudio se realizó en 26 diferentes cepas y clones del parásito. Aproximadamente el 50% de los cromosomas del parásito has sido identificados por marcadores lo que implica que falta obtener otros marcadores específicos, probablemente provenientes de EST (expressed tagged sequences) que definan cromosomas no caracterizados aún. También en este estudio se confirmó que el ADN repetitivo era más abundante en el cion CL Brener que en los otros ciones estudiados. Este hecho implica una gran desventaja en la elección de este clon para su mapeo y secuenciación, debido a la redundancia del material a analizar.

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Mapeo físico y transcrípcional del genoma del T. cruzi

Hemos comenzado el mapeo del genoma del T. cruzi, a nivel del clonado de cósmicos. Se está analizando una biblioteca genómica del parásito construida a partir de ADN genómico del cion CL Brener, en el cósmido modificado Lawrist 7. La "library" resultante consistió en 36.864 ciones primarios individuales de un promedio de 37 Kb. La representación de la library es de 25 equivalentes genómicos del parásito y fue realizada por el Dr. Joerg Hoheisel, del laboratorio de Análisis de Genomas, Heidelberg, Alemania. El desarrollo que ha alcanzado la aplicación de las técnicas de hibridación ha posibilitado el análisis detallado de extensas regiones de diferentes genomas como también de genomas completos. Las hibridaciones permiten un examen paralelo de un gran número de clones y la posibilidad de ubicar los ciones de la library en filtros de alta densidad permite una caracterización inequívoca de cada cion positivo ("fingerprinting") como se requiere para ensamblar un mapa. El objetivo de esta parte de trabajo es ordenar la genoteca de cósmidos mediante un análisis por "fingerprinting" en un mínimo conjunto de ciones que superpongan secuencias de ADN ("contigs") para obtener un mapa de alta resolución que permita la localización física de marcadores genéticos. Dado que el genoma del T. cruzí es de 80 a 100 Mb, la library de contigs tiene un inserto promedio de 37 Kb, que cada cósmido debe ser hibridizado por lo menos 3 veces por una sonda y que se usan pooles de 12 sondas para hibridar la library completa, el cálculo del número de hibridizaciones que son necesarios para obtener un mapa confiable del parásito es de aproximadamente 1100. Diferentes estrategias han sido utilizadas hasta el momento para hibridar la library de cósmidos. Se realizaron 70 hibridaciones con pooles de 12 y de 24 clones de cósmidos y unas 200 hibridaciones con pooles de 12 ciones de ADNc amplificados por PCR. Las hibridaciones con clones de ADNc muestran una disminución del ruido de fondo respecto de los cósmicos marcados y a partir de estos resultados se decidió utilizar esta library de ADNC, normalizada, construida por el Dr. Edson Rondinelli, del Instituto de Biofísica Carlos Chagas, Universidad de Río de Janeiro, para generar las sondas por PCR. Los resultados de las hibridaciones, que son exposiciones a filmes radiográfiros, han sido leídos manualmente. Los ciones positivos se analizaron por programas escritos especialmente para el análisis de genomas y procesados en un equipo SUN SPARC-11 en Heidelberg, Alemania. La obtención del mapa físico del T. cruzi será un logro fundamental para apoyar los posteriores proyectos de secuenciación de bases del ADN del parásito, evitando la redundancia de secuencias en regiones de ADN presentes en los cósmidos que superponen información. Los datos que el proyecto genoma del T. cruzi genera, pueden ser consultados en la base de datos disponible en la página de lnternet: http://www.dbbm.fiocruz.br/genome/tcruzi/tcruzi.html coordinada por el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Fundación Osvaldo Cruz, en Río de Janeiro. La misma contiene datos parasitológicos y biológicos de la cepa de referencia, todas las secuencias del T. cruzi provenientes de bancos de datos y las generadas por este proyecto, datos de las bibliotecas disponibles, listas de actividades y los grupos participantes.

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Actualización
14/Mar/2000