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Efecto del bloqueo de canales  T y L en la liberación de óxido nítrico inducido por el flujo coronario

González Garduño Amalia Enriqueta1; Torres Narváez Juan Carlos1;
Del Valle Mondragón Leonardo1; Suárez Munguía Jorge2;
Pastelín Hernández Gustavo1.

1) Departamento de Farmacología. Instituto Nacional de Cardiología
"Ignacio Chávez". Ciudad de México. México. 2) Escuela Superior de Medicina,
Sección de Graduados, I.P.N. Ciudad de México. México

Abstract
Introducción
Material y Métodos
Objetivos
Discusión
Conclusiones

 

Abstract
Introducción: En el endotelio vascular se liberan una gran cantidad de sustancias bioactivas, entre las que se encuentra el óxido nítrico (ON) que es un factor de relajación importante para la regulación del tono vascular. Se sintetiza en el endotelio por medio de la óxido nítrico sintasa (ONS), la cual, presenta tres isoformas: la inducible, la endotelial y la constitutiva, esta última es dependiente de Ca++. El flujo coronario estimula la liberación de ON por un mecanismo desconocido en donde está involucrado un incremento en la concentración de Ca++.
Objetivo: Explorar la participación de los canales de Ca++ tipo "T" y "L" en la liberación de ON en respuesta al flujo.
Metodología. Se utilizó el modelo de Langendorff para corazón aislado de cobayo a diferentes velocidades de perfusión arterial en condiciones basales y con inhibidores específicos para canales de Ca++ tipo "L" (Verapamil) y tipo "T" (Mibefradil). La cuantificación de ON se estimó midiendo la reducción de oxihemoglobina por el ON a metahemoglobina.
Resultados: El bloqueo de canales tipo "T" con mibefradil inhibió la liberación de ON. El verapamil (bloqueador de los canales tipo "L") provocó una inhibición menor. La combinación de los dos antagonistas de Ca++ potenció el efecto inhibitorio.
Conclusiones: Los antagonistas de Ca++ estudiados, inhiben la liberación de ON inducido por el flujo coronario indicando que los canales "T" y "L" están relacionados con el efecto del flujo.

Tope

Introducción:

El corazón es el órgano encargado de generar la presión de perfusión de todo el organismo y a su vez, este es perfundido por medio de la circulación coronaria. Diversos trabajos demuestran que el flujo coronario juega un papel importante como estimulador para la liberación de substancias vasoactivas en el corazón, entre estas se encuentra el Óxido Nítrico (ON), que es un vasodilatador. Los mecanismos que regulan su liberación no se han dilucidado por completo. La síntesis de ON involucra a la L-arginina como precursor que mediante la Óxido Nítrico Sintasa (ONS), la cual es dependiente de Ca2+, genera dos productos: L-Citrulina + ON.
Se sabe que la entrada de Ca2+ a la célula es por diversas vías, entre las que podemos mencionar los canales iónicos activados por estiramiento, canales acoplados a segundos mensajeros, canales dependientes de los gradientes electroquímicos y canales de Ca2+ voltaje dependientes como son los de tipo T y tipo L, los cuales se han descrito en diferentes tipos celulares como el miocito cardiaco, células del músculo liso, neuronas y además en células endoteliales microvasculares de médula adrenal de bovino y cerebro de rata (Vinet y Vargas: 1999).
En el presente trabajo exploramos como influyen los antagonistas de canales de Ca2+ tipo T y tipo L sobre la síntesis de ON en corazones aislados de cobayo expuestos a variaciones en la velocidad de perfusión coronaria.

Material y Métodos:

Se utilizaron cobayos machos de 250 a 300gr. anestesiados con Pentobarbital a una dosis de 0.1ml/100gr p.v. por vía intraperitoneal. Se utilizó el método de Langendorff para corazón aislado de cobayo a flujo constante, variando la velocidad de perfusión a 5, 10, 15, 20 y 25 ml/min. Como medio de perfusión se utilizó una solución de Krebs a una temperatura de 37oC con un pH de 7.4 y burbujeo de carbógeno al 5%. Después de 30 min. en que el corazón es mantenido en un periodo de adaptación, se realiza lo siguiente:

  1. El corazón se controla con un estimulador eléctrico.
  2. Se adiciona oxihemoglobina (2µM) al medio de perfusión.
  3. Se toma una muestra como blanco para el estudio espectrofotométrico.
  4. Se colecta la muestra del líquido efluente para cada flujo.
  5. La administración del fármaco correspondiente es por infusión contínua.
  6. Las muestras se colectan en intervalos de 3 min. entre cada variación de flujo.
  7. Se registra la presión de perfusión.
  8. Se registra la presión ventricular izquierda mediante un transductor intraventricular.
  9. El cálculo de la resistencia vascular se realiza dividiendo la presión de perfusión entre la velocidad de flujo.

Como bloqueadores de los canales de calcio se utilizaron los siguientes fármacos: Mibefradil a una concentración de 8µM, para bloquear los canales tipo T. Como bloqueadores de canales tipo L, se utilizó Nifedipina a una concentración de 8µM y Verapamil a una concentración de 300 nM. La cuantificación del ON se realizó basándose en el método de Schrader 1989 y por un análisis espectrofotométrico, en el que se mide la reducción de oxihemoglobina a metahemoglobina.

Objetivos:

Explorar la participación de los canales de Ca2+ tipo T y tipo L en la liberación de ON en corazones aislados de cobayo.

Discusión:

Como se muestra en nuestros resultados, los antagonistas de calcio utilizados afectan la liberación basal de ON significativamente e inhiben el efecto del flujo coronario sobre la liberación de ON.
En la literatura reciente existen reportes en donde se descarta la existencia de canales de calcio dependientes de voltaje en células endoteliales de aorta. Sin embargo, se han descrito este tipo de canales en células endoteliales microvasculares de médula adrenal de bovino y cerebro de rata. No existen reportes que acepten o nieguen la existencia de estos canales en el endotelio coronario y los resultados del presente trabajo sugieren la presencia de estos canales en el endotelio por el efecto que tienen al bloquear la liberación de ON.
Por otra parte, el estímulo del flujo afecta primariamente a las células endoteliales y la liberación de ON estimulada por el flujo se esperaría que fuera de las células endoteliales. Los antagonistas de canales T y L inhiben el efecto estimulador del flujo coronario en la liberación de ON por lo que podríamos pensar que están actuando sobre las células endoteliales y por consiguiente estas cuentan con canales voltaje dependientes. Otra posibilidad es que el ON que medimos provenga de los miocitos cardiacos ya que estos también expresan a la ONS constitutiva y además es bien sabido que cuentan con los canales voltaje dependientes. Sin embargo, no sabemos que proporción del ON que medimos provenga del endotelio y cual de los miocitos cardiacos u otros tipos celulares. Un dato a favor de que es el endotelio es que la fuerza de contracción del ventrículo no es afectada de manera significativa por la concentración utilizada en estos experimentos y si afecta la liberación de ON. La contracción también es dependiente de calcio y se esperaría que se afectara igual que la síntesis de ON si esta estuviera ocurriendo en la misma célula

Conclusiones:

La liberación de ON aumenta conforme se incrementa la velocidad de perfusión coronaria, indicando que existe un mecanismo relacionado con el flujo coronario y la liberación de este gas.

La liberación de ON es por diversas vías ya que al momento de bloquear los canales de calcio tipo T y tipo L, aun existe cierta liberación de este gas en el corazón aislado de cobayo.

Al bloquear los canales de calcio tipo T y tipo L la liberación de ON disminuye significativamente, sugiriendo una participación importante de este tipo de canales en el corazón aislado de cobayo.

El hecho de que los antagonistas de canales de calcio tipo T y L afecte la liberación de ON en el corazón, sugiere la existencia de estos canales en el endotelio vascular coronario.

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Fig. 1: Efecto del bloqueo de canales de Ca2+ tipo T sobre la liberación de óxido nítrico.
En la figura se muestra que al bloquear los canales de calcio tipo T con Mibefradil (círculos blancos), la síntesis de ON disminuye significativamente en todos los puntos un 40% con respecto al control (círculos negros) p<0.05, (n=5). Aunque la acción de la enzima esta disminuida aún hay respuesta celular al flujo sugiriendo que la entrada de calcio a la célula es por diversas vías.

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Fig. 2: Efecto del Verapamil sobre la liberación de ON en el endotelio vascular coronario.
En la figura se muestra que el Verapamil (círculos blancos), bloqueador de canales de Ca2+ tipo L, disminuye de manera significativa la liberación de ON al compararlo con el control (círculos negros) en la célula endotelial vascular coronaria (P>0.05, (n=5)). Inclusive se observa que conforme aumenta la velocidad de perfusión, la cantidad de ON es creciente a pesar de estar bloqueada la entrada de calcio por esta vía.

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Fig. 3: Efecto de la Nifedipina sobre la liberación de ON en el endotelio vascular coronario
En la figura se muestra una disminución significativa P<0.05, (n=5) en la liberación de ON al bloquear los canales de Ca2+ tipo L con Nifedipina (círculos blancos), en comparación al control (círculos negros). Esto da la pauta a pensar que en el endotelio vascular coronario, también pueden localizarse canales de Ca2+ tipo L, ya que al momento de administrar un bloqueador selectivo para estos, se limita la actividad de la ONSc que es dependiente del ión.

 

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Fig. 4: Efecto de la Nifedipina sobre la presión ventricular izquierda.
En la figura se muestra que al bloquear los canales de Ca2+ tipo L con Nifedipina (círculos blancos) y variar la velocidad del flujo de perfusión, no se observan cambios significativos en la presión ventricular izquierda al compararse con el control (círculos negros). p>0.05, (n=5).

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Fig. 5: Efecto del bloqueo de canales Ca2+ tipo T y tipo L sobre la liberación de ON en el endotelio vascular coronario.
Al bloquear conjuntamente los canales de Ca2+ tipo T y tipo L (círculos blancos), existe una disminución significativa P<0.05, (n=5) en la liberación de ON en el endotelio vascular coronario al compararlo con el control (círculos negros). Con estos resultados se puede sugerir que los canales de calcio tipo T y tipo L, participan en la entrada del ión a la célula, pero sin inhibir totalmente la liberación de ON.

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Fig. 6: Efecto del bloqueo de canales de Ca2+ tipo T y tipo L sobre la presión ventricular izquierda.
En la figura se muestra que en condiciones control (círculos negros) al incrementar la velocidad de perfusión coronaria la presión ventricular izquierda aumenta proporcionalmente. Al bloquear conjuntamente los canales de Ca2+ tipo T y tipo L, la respuesta al cambio de flujo es prácticamente igual, ya que no se afecta significativamente la contracción ventricular p>0.05, (n=5).


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Oct/31/1999


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