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Características del efecto inhibidor del INCICH-D7 sobre ATPasa-Na+,K+

Ramírez Margarita; Del Valle Leonardo; Pastelín Gustavo

Departamento de Farmacología. Instituto Nacional de Cardiología "Ignacio Chávez"
México D.F.  México

Abstract
Introducción
Objetivos
Material y Métodos
Resultados
Discusión
Conclusiones

Abstract
Introducción:
La interacción de los digitálicos con su receptor la ATPasa-Na+,K+ involucra un sitio de unión para el azúcar y otro para la genina; los estudios clásicos donde se relaciona la estructura de los digitálicos con la actividad farmacológica señalan que los compuestos 14ß-hidroxiesteroides sustituidos en posición 17ß con un anillo lactónico insaturado son los que poseen mayor actividad digitálica. El INCICH-D7 [14ß,17ß-ciclocetoéster-3ß-OH androstano] (D7) compuesto sintetizado a partir de la Digitoxigenina no posee el -OH en posición 14 ni el anillo lactónico en posición 17, entre estas dos posiciones se ha logrado una fusión heterocíclica de tipo cetoéster, éste derivado retiene su actividad inotrópica positiva y posee un margen de seguridad superior al de la Digitoxigenina y al de la ouabaína.
Objetivo:  Averiguar si el D7 retiene además la capacidad de inhibir a la ATPasa-Na+,K+ y conocer las características de la interacción del nuevo derivado con esta enzima.
Métodos: Trabajamos con una preparación enzimática purificada obtenida de riñón de perro. Se midió la velocidad de hidrólisis de ATP en presencia de concentraciones crecientes de Ouabaína, Digitoxigenina y D7
Resultados: El D7 inhibe a la ATPasa-Na+,K+ siguiendo un comportamiento no-competitivo, la capacidad de inhibición del D7: IC50=4µM es 5 veces más baja que la de la Ouabaína: IC50=0.8µM y 70 veces más baja que la de Digitoxigenina: IC50=0.06µM
Conclusiones:  D7 retiene la capacidad inhibidora sobre la ATPasa-Na+,K+. La sustitución del anillo lactónico y del grupo OH en posiciones 17 y 14 respectivamente por el heterociclo en la molécula de Digitoxigenina produce una significante disminución del efecto inhibidor sobre la ATPasa-Na+,K+.

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Introducción: El tratamiento farmacológico de la insuficiencia cardiaca congestiva se basa principalmente en el empleo de glucósidos cardíacos o digitálicos. El estrecho margen de seguridad de los digitálicos ha sido hasta el momento un problema por la severidad de la intoxicación digitálica. Por tal motivo numerosos estudios se han enfocado a modificar la estructura química de estos compuestos variando las substituciones sobre el núcleo esteroideo con el fin de mantener el efecto farmacológico con una mínima toxicidad.

El compuesto 14ß,17ß-ciclocetoéster-3ß-OH-androstano (INCICH-D7) digitálico diseñado y sintetizado en el Depto. de Farmacología del Instituto Nacional de Cardiología "Ignacio Chávez", carece del anillo lactónico en posición 17 y del hidroxilo en posición 14. En lugar de estos grupos se ha logrado una fusión cíclica en posición ß de tipo cetoéster entre dichos carbonos, dándose lugar a un nuevo heterociclo químico dentro de la estructura esteroidea (Fig. 1). Este nuevo compuesto sintetizado a partir de la Digitoxigenina conserva su actividad inotrópica positiva demostrada ya en el miocardio de cobayo (preparación de Langendorff) y en el corazón canino (preparación cardiopulmonar de Starling).

Figura 1 -  Digitálicos empleados en el estudio

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La ATP fosfohidrolasa dependiente de Na+ y de K+ [ATPasa-(Na+,K+)] es el blanco farmacológico de los glucósidos cardíacos y la hipótesis más aceptada del mecanismo de acción del efecto inotrópico de estos fármacos sobre el miocardio. La inhibición parcial de esta enzima, causa un incremento en la concentración de Na+ intracelular, lo cual a su vez afecta el intercambiador Na+/Ca2+ del sarcolema, llevando a un incremento del Ca2+ intracelular y en la fuerza de contracción cardíaca.

Objetivos: Investigar si el compuesto digitálico de síntesis INCICH-D7 además de la actividad inotrópica positiva, retiene la capacidad de inhibición sobre la ATPasa-(Na+,K+); tomando como punto de referencia la acción de la Ouabaína y de la Digitoxigenina.

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Material y Métodos:  Digitálicos.- La Ouabaína y la Digitoxigenina se obtuvieron de origen comercial (Sigma Chemical Co.), el INCICH-D7 fue sintetizado en nuestro laboratorio a partir de Digitoxigenina y su estructura se determinó por medio de cristalografía por difracción de rayos "X".

La purificación de la ATPasa-(Na+,K+) de riñón de perro se hizo siguiendo el procedimiento de Jorgensen (1974). Las preparaciones enzimáticas obtenidas fueron inhibibles por Ouabaína 50 µM. La actividad de ATPasa dependiente de Na+ y K+ se determinó en las siguientes condiciones estándar: NaCl 100 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, TEA-HCl 50 mM pH 7.4, EGTA 0.2 mM, NaN3 5 mM y ATP 2.5 mM. La concentración de proteína en el medio de reacción fue de 7 µg/ml. El tiempo de reacción fue de 10 minutos y la temperatura 37oC. Al término de la reacción se adicionaron 500 µl de ácido tricloroacético (TCA) al 10% frío y se centrifugó a 3000 RPM durante 5 minutos. El Pi liberado por la hidrólisis de ATP se determinó en una alícuota de 500 µl por el método de Taussky y Shoor (1953).

Estudios de inhibición de ATPasa-(Na+,K+) por digitálicos.- El efecto de Ouabaína, Digitoxigenina e INCICH-D7 se determinó en el medio de reacción estándar variando las concentraciones del digitálico de 0.1 nM a 1 mM. Las actividades de ATPasa-(Na+,K+) a cada concentración del inhibidor correspondiente se expresaron como porciento de la actividad de ATPasa-(Na+,K+) total en ausencia del inhibidor. Los valores de % de actividad se graficaron en función del logaritmo de la concentración de los digitálicos (Fig. 2) y de estas curvas se obtuvieron los valores de I50 . El valor I50 es la concentración de inhibidor que produce el 50% de la inhibición. El valor de Ki para INCICH-D7 se obtuvo sustituyendo los valores de Vmáx obtenidos de la gráfica de dobles recíprocas (Fig. 3-B) en la ecuación: 1/Vmáxi = (1+[I]/Ki)/Vmáx, donde Vmáx es la velocidad de hidrólisis máxima en ausencia de INCICH-D7 y Vmáxi es la velocidad de hidrólisis máxima obtenida en presencia de INCICH-D7.

Figura 2

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Figura 3

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Resultados: En la fig. 1 se presentan las estructuras químicas de: INCICH-D7, Digitoxigenina y Ouabaína. Experimentalmente se estudió el efecto de INCICH-D7 sobre la actividad de ATPasa-(Na+,K+) y se comparó con el efecto de Digitoxigenina y Ouabaína.

En la fig. 2 se grafican los valores remanentes de actividad hidrolítica de ATPasa-(Na+,K+) por efecto de los 3 digitálicos estudiados, tomando como control (100% de actividad) la hidrólisis de ATP en las mismas condiciones de reacción en ausencia del digitálico. En esta gráfica se muestra la curva dosis respuesta obtenida para el efecto del INCICH-D7, Digitoxigenina y Ouabaína, observamos que el nuevo digitálico tiene un efecto inhibidor sobre la ATPasa-(Na+,K+), la inactivación de la enzima sigue un trazo sigmoidal y éste está desplazado hacia la derecha con respecto a los trazos obtenidos con Digitoxigenina y Ouabaína. Los valores de I50 se muestran en la tabla I. El valor de la Ki para el efecto inhibidor de INCICH-D7 sobre ATPasa-(Na+,K+) se obtuvo trabajando a dos concentraciones fijas de éste, que lograran una inhibición entre el 70 y el 30%. Los valores de velocidad de hidrólisis de ATP se graficaron en forma de doble recíproca fig 3 para obtener la Vmáx y Ks del efecto activador del ATP en presencia y en ausencia del INCICH-D7 el valor de Ki se obtuvo sustituyendo los valores de Vmáx como se indicó en material y métodos, el valor de Ki fue de 4 µM. Los valores de Vmáx y Ks obtenidos se presentan en la tabla II en ella podemos apreciar que la Vmáx de hidrólisis de ATP disminuye conforme incrementa la concentración del digitálico mientras que la Ks permanece prácticamente invariable lo que corresponde a un patrón de inhibición no competitivo.

Tabla I

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Tabla II

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Discusión: La interacción de las drogas digitálicas con su receptor [ATPasa-(Na+,K+)] involucra un sitio de unión para la genina y un sitio de unión para el azúcar, los azúcares particulares unidos a la genina modifican su solubilidad en agua y lípidos así como su potencial farmacológico; el anillo de lactona insaturada tiene dos características principales: 1) un centro deficiente en electrones C20 y 2) un centro rico en electrones C = O el cual a pH fisiológico existirá como anión, estas dos consideraciones le confieren a la molécula 2 puntos de unión con el receptor por medio de interacciones electrostáticas y puente de hidrógeno, el número y posición de los grupos -OH en el esqueleto esteroideo proporcionan a la molécula posibilidades de formar puentes de hidrógeno con la proteína, además de las interacciones de tipo hidrofóbico por la molécula esteroidea.

Los estudios clásicos donde se relaciona la estructura de los glucósidos digitálicos con la actividad farmacológica señalan que, los compuestos 14ß-hidroxi-esteroides sustituídos en posición 17ß con un anillo lactónico insaturado son los que poseen mayor actividad digitálica (Thomas 1980). En el presente estudio hemos analizado los efectos que tiene el nuevo compuesto digitálico INCICH-D7 sobre la ATPasa-(Na+,K+), éste no posee el -OH en posición 14 ni la lactona en posición 17 (Fig 1) y encontramos que la nueva estructura mantiene su actividad inhibidora sobre la ATPasa-Na+,K+ I50 = 4 µM aunque 70 veces menos potente que la mostrada por Digitoxigenina I50 = 0.06 µM y 5 veces menos potente que la de Ouabaína I50 = 0.8 µM. Para que haya un efecto inhibitorio sobre la actividad de hidrólisis de ATP dependiente de Na+ y K+ no es indispensable ni el azúcar ni los grupos 1ß-OH, 5ß-OH y 11a -OH presentes en la molécula de la ouabaína ya que Digitoxigenina que no los tiene dentro de su estructura la inhibe con más potencia, INCICH-D7 no posee el centro deficiente en electrones del anillo lactónico lo que hace que tenga menos sitios de interacción con el receptor y por lo tanto su potencia inhibidora se ve disminuída.

El modelo de inhibición al que se ajusta el INCICH-D7 es el no competitivo ya que al interaccionar con la enzima disminuye la velocidad máxima de hidrólisis pero no modifica la afinidad por el sustrato ya que la Ks prácticamente permanece invariable Tabla II.

Este nuevo compuesto digitálico es una nueva herramienta para determinar los requerimientos estructurales y conformacionales del sitio de unión para las geninas sobre la ATPasa-Na+,K+.

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Conclusiones: Las modificaciones hechas a la molécula de la Digitoxigenina no afectan su capacidad para inhibir a la ATPasa-(Na+,K+).

El anillo lactónico y el grupo –OH en las posiciones 17 y 14 respectivamente no son necesarios para ejercer el efecto inhibidor sobre la enzima.

La sustitución del anillo lactónico y del grupo –OH en posición 14 por el heterociclo en la molécula de Digitoxigenina provoca que la capacidad inhibitoria sobre la ATPasa-(Na+,K+) disminuya considerablemente.

 

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Dic/23/99


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