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[ Scientific Activity - Actividad Científica ] [ Brief Communications - Temas Libres ]

Efeitos da Crise Hipertensiva sobre os Marcadores de Lesão Celular

Martin José F. Vilela; Barbieri Neto José; Lachat João José; Furtado Mozart R. Fortes.

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Ribeirão Preto, SP, Brasil.

Abstract
Introdução
Material e Métodos
Resultados
Conclusões
Bibliografía

Abstract
Introdução: Durante uma crise hipertensiva é provável que ocorra vasoconstricção acompanhada de isquemia relativa aos tecidos. Segue-se a fase de relaxamento vascular e retorno a níveis mais baixos de pressão arterial (PA). Essa segunda fase, considerada de reperfusão, pode acompanhar-se de reoxigenação tecidual suficiente para formar radicais livres de oxigênio (RL).
Objetivo: Demonstrar a possível formação de RL em tecidos miocárdico, renal e cerebral através de crises hipertensivas provocadas em ratos espontaneamente hipertensos (SHR).
Material e Métodos: Utilizaram-se ratos SHR (n=61) com peso corpóreo entre 230 e 300g e Pressão Arterial Média (PAM) = 186,06± 2,99 mmHg. Fenilefrina (PHE) foi infundida à taxa de 15 m g/min em bomba de infusão por 30 min e, a seguir, procedeu-se à coleta do sangue com 1, 5 e 10 minutos ao final da elevação pressórica, para dosagem de enzimas transaminase glutâmico oxalacética (TGO), creatinofosfoquinase (CPK) e desidrogenase láctica (LDH). Sangue foi colhido para estudo da presença de RL através de ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Colheram-se coração, cérebro e rim para dosagem de malondialdeído (MDA), produto de peroxidação lipídica. Ratos SHR infundidos com solução salina 0,9% na mesma taxa foram usados como controle e procedeu-se à coleta do mesmo material nesse grupo.
Resultados: Ocorreu elevação enzimática (TGO, CPK e LDH) em todos os momentos de coleta em relação ao grupo controle. Não foram encontradas espécies radicalares na EPR e não houve diferença entre os valores encontrados para MDA nas condições experimentais investigadas (SHR com ou sem PHE).
Conclusões: Embora a elevação enzimática sugira que lesão tecidual esteja ocorrendo, a ausência de RL e de alteração de MDA não recomenda a participação de RL na gênese da cardiopatia catecolaminogênica, mesmo não excluindo essa possibilidade.

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Introdução:

A literatura médica tem mostrado que uma maior variabilidade da PA cursa com pior prognóstico da hipertensão arterial. Mas uma questão a ser respondida seria quais os mecanismos e as lesões orgânicas que poderiam estar atuando como responsáveis por esse pior prognóstico. Durante esses momentos de variabilidade pressórica ¾ caracterizados por picos hipertensivos , com maior prevalência em indivíduos hipertensos ¾ é possível que ocorra vasoconstricção acompanhada de isquemia relativa, à qual se segue a fase de relaxamento vascular e retorno a níveis mais baixos de pressão arterial. Essa segunda fase de reperfusão pode acompanhar-se de reoxigenação tecidual suficiente para levar à formação de radicais livres de oxigênio (RLs) (figura 1). Nessas condições, pode haver lesão oxidativa microvascular (principalmente em órgãos-alvo). Essa condição lembra o modelo de isquemia-reperfusão muito abordado em estudos de corações isolados [1] e de oclusões do fluxo sangüíneo coronariano [2], que cursa com alterações provocadas pelos RLs gerados durante a reperfusão: a) metabolismo anaeróbico, b) mudanças ultra-estruturais intracelulares e c) destruição das membranas celulares com liberação enzimática e conseqüente morte celular [3]. Radical livre de oxigênio (também chamado radical de oxigênio ou oxi-radical) é uma molécula ou átomo de oxigênio que possui um ou mais elétrons em sua orbital mais externa não pareados com outros de rotação inversa (spins) na mesma camada orbital, fato que lhe confere alta reatividade e torna-o instável, de vida curta. Os RLs podem ser mediadores de injúria vascular em diversas condições, incluindo hipertensão aguda [4], situações de isquemia/reperfusão [5], processos ateroscleróticos [6], senilidade. Em relação à hipertensão arterial, não há demonstração da participação direta dos RLs nas lesões teciduais, mas somente evidências indiretas de sua ação [7,8].
O presente trabalho utilizou a variabilidade da PA como um modelo de isquemia/reperfusão e teve por objetivos: 1 - Investigar a geração de RLs durante a fase de reperfusão de uma crise hipertensiva, indiretamente pelas alterações enzimáticas e através de avaliação da peroxidação lipídica. 2 - Investigar a geração de RLs de forma direta através de sua detecção por ressonância paramagnética eletrônica.

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Fig. 1: Representative diagram of the ischemia/reperfusion episode during a bigger variability of blood pressure registered in blood pressure monitoring.

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Material e Métodos:

Foram utilizados ratos espontaneamente hipertensos (SHR) machos entre 230 e 300 g de peso corpóreo com pressão arterial média (PAM) basal de 186,06 ± 2,99 mmHg. Um dia antes do experimento os ratos anestesiados com éter foram submetidos à canulação da carótida esquerda e jugular direita para registro da pressão arterial e infusão de drogas, respectivamente.
Grupo 1 (n=10) ® Os ratos SHR foram submetidos à elevação da PA através da infusão contínua de fenilefrina (PHE) a uma taxa de 15 m g/min por 30 minutos e, a seguir, coletou-se sangue 1, 5 e 10 minutos ao final da elevação pressórica para dosagem das enzimas transaminase glutâmico-oxalacética (TGO), desidrogenase láctica (LDH) e creatinofosfoquinase (CPK) utilizando-se os reagentes específicos. Após a coleta do sangue os ratos foram sacrificados e colheram-se coração, cérebro e rim para dosagem de malondialdeído (MDA), produto da peroxidação lipídica. A peroxidação lipídica é um processo complexo que pode ocorrer em membranas biológicas constituídas de ácidos graxos poliinsaturados reagentes ao oxigênio molecular, levando à produção de hidroperóxidos lipídicos e seus metabólitos. A maioria dos casos envolvendo peroxidação lipídica inicia-se através de uma reação em cadeia que se propaga, mediada pela presença de RLs. Os hidroperóxidos lipídicos acumulam-se na membrana, inativando seus receptores e enzimas, prejudicando suas funções, levando a sua desestabilização e tornando-a permeável a íons [9]. Um método simples e de alta sensibilidade muito utilizado como um marcador de peroxidação lipídica é a reação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (ATB), dentre elas os derivados dos hidroperóxidos lipídicos, como o malondialdeído, MDA. A determinação colorimétrica de uma substância reativa ao ATB é realizada com leitura em espectrofotômetro a 535 nm.
Grupo 2 (n=10) ® Visando investigar a presença de RLs através da ressonância paramagnética eletrônica, os ratos SHR foram submetidos a uma crise hipertensiva administrando-se fenilefrina a uma taxa de 15 m g/min/30 min associada a um agente captador de spins ("spin-trap") PBN (N-tert-butyl alfa-phenylnitrone) 50mM, em bomba de infusão, a fim de manter uma concentração estável do spin-trap, capaz de captar RLs e permitir a sua detecção. Toda a solução infundida foi protegida da luz, uma vez que o agente PBN é fotossensível. Imediatamente após o término da infusão de fenilefrina e de PBN, ou seja, ao término da crise hipertensiva, o sangue foi coletado e suspenso em 0,4 ml de solução de tolueno, agitado por 20 segundos e centrifugado por 20 min a 5000 rpm. Em sequência, retirou-se o sobrenadante que foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e submetido à análise espectrométrica visando detectar RLs. A ressonância paramagnética eletrônica (RPE) é um método direto de avaliação da presença de RLs, capaz de fornecer energia, no caso microondas, aos elétrons desemparelhados. As microondas incidindo sobre os elétrons podem mudar a sua orientação e seu estado de energia. A absorção das microondas pelos elétrons é detectada por um cristal no espectrômetro de ressonância paramagnética. Ao colocar-se amostras de sangue no guia de ondas (campo das microondas) e aplicar-se um campo magnético externo, busca-se detectar a existência de centros paramagnéticos contendo número ímpar de elétrons com spins desemparelhados (RLs). Nesse instante, a corrente no detector cai, sendo a queda correspondente à energia absorvida pela amostra (figura 2) [10].
Grupo 3 (n=10) ® Ratos SHR infundidos com solução salina 0,9% na mesma taxa foram usados como controle e procedeu-se à coleta do mesmo material dos grupos 1 e 2.

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Fig. 2: Representative diagram of the spectrophotometer (EPR)

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Resultados:

Os ratos dos grupos 1 e 2 apresentaram PAM de 231,35 ± 4,51 mmHg durante a infusão de PHE e os ratos do grupo 3 (controle) apresentaram PAM de 172,0 ± 9,24 mmHg (figura 3).

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Fig. 3: Result of the blood pressure during a hypertensive crisis.

A média de TGO do grupo experimental (n=10) foi de 214 ± 31,56 U/l; 202,75 ± 27,3 U/l e 205,32 ± 27,39 U/l aos 1, 5 e 10 min após infusão de PHE, respectivamente, com p = 0,0106 em relação ao controle. No grupo experimental a média de CPK foi de 134,37 ± 14,76 U/l; 134,87 ± 27,74 e 74,87 ± 11,27 aos 1, 5 e 10 min, respectivamente, com p = 0,0004 em relação ao controle. No grupo experimental a média de LDH foi de 595 ± 123,93 U/l; 632,37 ± 124,36 U/l e 598,75 ± 129,92 U/l aos 1, 5 e 10 min, respectivamente, com p = 0,0075 em relação ao controle (figura 4).

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Fig. 4: Results of the enzymatic profile after a hypertensive crisis. A - Glutamic-oxalacetic
transaminase (GOT) B - Creatine-phosphokinase (CPK) C - Lactic dehydrogenase (LDH)

Não houve diferença entre os níveis médios de MDA para os grupos controle e experimental nos órgãos examinados (p >> 0,05). Em referência aos resultados da RPE não foi possível a detecção de espécies radicalares nos experimentos, como demonstra a figura 5.

 
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Fig. 5: Free radical spectra in the eletronic paramagnetic resonance records

 

Conclusões:

A ausência de espécies radicalares na RPE não afasta a possível formação de radicais livres de oxigênio durante os momentos de intensa variabilidade pressórica, pois podem estar ocorrendo em concentrações tão baixas que a sensibilidade do instrumento não permitiu detectá-los. Além disso, é possível também que a manipulação dos tecidos antes das medidas de RPE possa ter destruído radicais (eventualmente) formados. A atividade enzimática elevada de TGO, CPK e LDH constitui importante evidência indireta sugestiva de lesão oxidativa tecidual. Contudo, os métodos mais apropriados da pesquisa da produção de oxi-radicais (ressonância paramagnética eletrônica e determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) não confirmaram essa possibilidade.
A ausência de RLs e de alteração de MDA não recomenda a participação de espécies radicalares na gênese da cardiopatia catecolaminogênica, mesmo não excluindo essa possibilidade.

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Bibliografía

1. Garlick PB, Davies MJ, Hearse DJ, Slater TF. Direct detection of free radicals in the reperfused rat heart using electron spin resonance spectroscopy. Circ Res 1987; 61: 757-760.
2. Bolli R, Patel BS, Jeroudi MO, Lai EK, McCay PB. Demonstration of free radical generation in "stunned" myocardium of intact dogs with use of the spin trap a -phenyl n-tert-butyl nitrone. J Clin Invest 1988; 82: 476-485.
3. Kukreja CR, Hess ML. The oxygen free radical system: from equations through membrane-protein interactions to cardiovascular injury and protection. Cardiovasc Res 1992; 26: 641-655.
4. Kontos HA, Wei EP, Dietrich WD, et al. Mechanism of cerebral arteriolar abnormalities after acute hypertension. Am J Physiol 1981; 240 (Heart Circ Physiol 9): H511- H527.
5. Bulkley GB. Free radical-mediated reperfusion injury: A selective review. Br J Cancer 1987; 55 (Suppl. VIII): 66-73.
6. Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, Khoo JC, Witztum JL. Beyond cholesterol: Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity. N Engl J Med 1989; 320: 915-924.
7. Kumar KV, Das UN. Are free radicals involved in the pathobiology of human essential hypertension? Free Radic Res Commun 1993; 19: 59-66.
8. Suzuki H, Swei A, Zweifach BW, Schmid-Schönbein GW. In vivo evidence for microvascular oxidative stress in spontaneously hypertensive rats - Hydroethidine microfluorography. Hypertension 1995; 25: 1083-1089.
9. Halliwell B, Chirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. Am J Clin Nutr 1993; 57 (Suppl): 715s-725s.
10. Kosman DJ. Electron Spin Resonance. Structural and Resonance Techniques in Biological Research 1984; 90-108.

 

Questions, contributions and commentaries to the Authors: send an e-mail message (up to 15 lines, without attachments) to hbp-pcvc@pcvc.sminter.com.ar , written either in English, Spanish, or Portuguese.

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Dic/23/1999


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