Niveles plasmaticos de CK y receptores solubles en la infeccion chagasica humana y experimental
Beatriz Basso, Liliana Cervetta y Edgardo Moretti
Cátedra de Pediatría y Neonatología
Facultad de Ciencias Médicas, Univ. Nac. de Córdoba
y Laboratorio del Servicio Nacional de Chagas
Córdoba, Argentina
La Enfermedad de Chagas es una de las principales endemias en América Latina, donde existen mas de 20 millones de individuos infectados. Si bien la transmision a través del insecto vector está disminuyendo en varios países por las medidas sanitarias adoptadas, aún existen extensas áreas en riesgo. Por otra parte, las vías congénita y transfusional adquieren importancia epidemiológica, debido a la gran cantidad de individuos capaces de transmitir la infección. La mayor incidencia de casos agudos ocurre en niños, y en la mayoría de ellos es clínicamente inaparente, (Moya y col. 1985, 1989) por lo cual es esencial contar con adecuadas herramientas diagnósticas, así como marcadores de eficacia terapéutica y predictores evolutivos.
La etapa aguda está caracterizada por un estado de inmunosupresión que favorece la instalación y diseminación del parásito en el huésped . (Kierszenbaum, Moretti, Stein, 1991,1993) seguida de parasitemia y producción incrementada de mediadores inflamatorios. Uno de los interrogantes aún sin respuesta es cuales son los mecanismos del parásito y del huésped determinantes de que, pasado el período agudo, en un alto porcentaje de casos el Trypanosoma cruzi se comporte toda la vida como un comensal, mientras que en aproximadamente el 30% de las personas infectadas induce algún grado de patología cardíaca o digestiva de distinta gravedad. Algunos grupos de investigación actualmente sostienen que el nivel de parasitemia inicial puede determinar, de alguna manera, la aparición de sintomatología en la fase crónica (Tarleton 1997). Por ello, si bien el desarrollo de vacunas tradicionales tanto en Enfermedad de Chagas como en otras enfermedades parasitarias, parece una meta difícil de alcanzar en el corto plazo, actualmente se piensa en estrategias basadas en la inmunointervención, a fin de prevenir el desarrollo de la patología. Para ello es necesario avanzar en el conocimiento de los mecanismos involucrados en la resistencia y en la patogenia de la enfermedad.
Por las características del T. cruzi, con un estadio intracelular y otro extracelular, la infección por este parásito representa un gran desafio para el sistema inmune del hospedador. En efecto, una respuesta efectiva contra el T. cruzi requiere de la inducción de múltiples mecanismos efectores, entre los que se incluyen una potente respuesta de anticuerpos contra las formas extracelulares y una respuesta celular eficaz contra el estadio intracelular. Por otra parte, en los estadios iniciales de la infección es esencial la respuesta innata o inespecífica, a través de sus efectores y moduladores celulares y moleculares. Así, las citoquinas (CK) y mediadores solubles juegan un papel fundamental durante la infección, ya que su actividad determina, en gran medida el inicio, duración y composición de las distintas vías efectoras de la respuesta inmune (Fresno et al. 1997). En los últimos años se han realizado numerosos estudios tendientes a analizar el rol que cumplen estos mensajeros químicos durante la infección por T. cruzi. Los primeros trabajos que se realizaron en este sentido asociaron la producción de CK liberadas por los linfocitos T helper (Th) 1, como el interferón gamma (IFN-g ) con el control de la parasitemia durante la fase aguda de la infección experimental (Reed 1988, Torrico et al. 1991). En contraste, la producción de CK de tipo Th2, en particular IL-10, se ha relacionado principalmente con un incremento en la susceptibilidad a la infección (Reed et al.1994). En consecuencia, el estudio de los niveles endógenos de algunas CK en una infección dada, ayudaría a determinar el fenotipo celular principalmente involucrado en la respuesta y, eventualmente, efectuar inferencias acerca del pronostico y evolución de la infección. (Zhang & Tarleton 1996).
El paradigma de la polarización Th1-Th2 en enfermedades parasitarias se visualiza en la Leishmaniasis experimental, donde claramente un aumento de CK producidas por LiTh1 (IL2, TNF alfa e IFNgama) se correlaciona con resolución de la infección, en cambio, incrementos de IL4, IL6 e IL10, sintetizadas por Li Th2 están asociadas con un mal pronostico de la enfermedad (Scott 1989). Dicha asociación entre perfil Th1 con resistencia y Th2 con susceptibilidad , no parece ser tan clara en la infección por T. cruzi. , donde existiría un mayor equilibrio entre los dos tipos celulares, Th1 y Th2 y, por ende, entre las CK por ellos producidas, mas que una polarización neta de la respuesta (Zhang & Tarleton 1996). Además, la producción de CK por otras células, como por ejemplo macrófagos y células NK (respuesta inmune innata) juega un rol crucial en estadios tempranos, cuando aun no se ha desencadenado la respuesta adaptativa.
Por otra parte, en infecciones humanas de diversa etiología, en los últimos años se ha centrado la atención en la medición de moléculas que pueden ser eficaces marcadores evolutivos. Se conoce que el Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFa ) y la Interleuquina 6 (IL6) están involucrados en procesos inflamatorios y en la patogénesis del shock séptico (Olsson et al. 1993, Wilson et al 1998), cuando su producción está incrementada a nivel sistémico. Asimismo, la producción de receptores de CK, su liberación y la posibilidad de su medición por métodos inmunoenzimáticos (Rubin et al 1986 ) puede tener interés clínico (Moretti et al.1994, 2000).
Con estos antecedentes, y los resultados obtenidos en estudios previos por nuestro grupo de trabajo, decidimos abordar el estudio de los niveles plasmáticos de CK y receptores solubles en la Enfermedad de Chagas experimental (TNFa , IL-6 e IL-10)y en la infección humana (TNFa , IL-6 y receptor soluble de IL-2 (IL-2R). Las determinaciones se realizaron empleando el método inmunoenzimático (ELISA).
El desarrollo a nivel experimental se realizó:
1. En un modelo de vacunación de
ratones BALB/c con formas de cultivo de Trypanosoma rangeli, parásito muy similar
al T. cruzi pero no patógeno para el hombre. Se empleó este modelo, por cuanto se
demostró en estudios previos que se lograba conferir protección a los animales frente a
la infección por formas virulentas del T. cruzi, incluso cuando el desafío con T.
cruzi se realizó por períodos mayores de 9 meses pos inmunización( Basso et al.
1991, Introini et al. 1998).
2. En ratones infectados y tratados con Benznidazol, droga tripanomicida de uso en
humanos.
En todos los grupos se analizaron los niveles plasmáticos de CK en distintos períodos post infección
A nivel humano, se estudiaron niños de hasta 14 años, con infección aguda demostrada por métodos parasitológicos, y otro grupo de la misma edad que cursaba la etapa indeterminada de la infección. En un subgrupo de los pacientes con infección aguda se analizaron muestras apareadas pre y post tratamiento. Como control se incluyó un grupo de niños no chagásicos.
Modelo experimental:
Efecto de la vacunación
Como se puede observar en la Fig 1, los niveles de CK en los animales previamente vacunados fueron significativamente diferentes a los sólo infectados, en estrecha correlación con las parasitemias obtenidas en los respectivos grupos. En efecto los resultados obtenidos con TNFa (Fig 1a) muestran que, a partir del día 13 post infección (pi) los niveles aumentaron dramáticamente en los ratones sólo infectados. En cambio, los animales inmunizados mostraron concentraciones significativamente menores, aunque superiores a los ratones control, no infectados. Merece destacarse que los animales vacunados resolvieron la infección, sobreviviendo en un 95% más allá de 320 días p.i. En cambio, los ratones sólo infectados murieron durante la infección aguda, antes de los 25 días. La Fig 1 b muestra el perfil de IL6 a lo largo del período agudo en ambos grupos, observándose un comportamiento similar a TNFa . Nuevamente el grupo de animales infectados mostró un significativo incremento en sus niveles plasmáticos a partir del día 13 p.i. Finalmente, en la Fig. 1 c se observan las concentraciones de IL10 en ambos grupos. En los animales solo infectados esta CK mostró elevadas concentraciones plasmáticas, nuevamente asociadas a las parasitemias, mientras que los animales previamente inmunizados mantuvieron sus niveles dentro del rango de la normalidad
Efecto del tratamiento
A los fines de analizar el efecto del tratamiento paraciticida sobre los niveles de CK proinflamatorias, y consecuentemente, si la determinación plasmática podía ser marcador de eficacia terapéutical, se realizaron dos tipos de tratamientos, uno completo a partir del dia de la infección, con dosis controladas de Beznidazol.y el segundo incompleto, consistió en disolver la droga en el agua del bebedero. La Fig 2, resume los resultados obtenidos. Como puede observarse, los ratones que recibieron un adecuado tratamiento antiparasitario nunca presentaron parasitemia detectable, y los niveles de TNFa (2a) e IL6 (2b) se mantuvieron dentro de la normalidad durante todo el período de estudio. Por el contrario, el grupo sometido a tratamiento incompleto presentaron parasitemia detectable y valores incrementados de ambas CK.
Infección humana
El estudio en pacientes que cursaban el periodo agudo de la infección permitió analizar los niveles de las mismas CK proinflamatorias en la infección natural. La Fig 3a muestra la concentración plasmática de TNFa , revelando niveles significativamente incrementados con respecto a los niños no chagásicos. Por su parte, cuando estos niños recibieron tratamiento paraciticida, se observó una tendencia descendente de esta CK. También merece mencionarse que los niños con infección en estado intermedio mostraron en promedio, niveles ligeramente incrementados de TNFa . Con respecto al estudio de los niveles séricos de IL6, (Fig. 3b) también se observó una tendencia en el grupo de niños con infección aguda a presentar niveles elevados, aunque mostrando en este caso mayor dispersión. Cuando se dosaron los niveles de IL2-R, se observó un marcado incremento de este receptor a nivel plasmático (Fig. 3c), y una disminución en respuesta a una adecuada terapéutica antiparasitaria.
Los mecanismos responsables del desarrollo de patología en la enfermedad de Chagas todavía no han sido bien dilucidados, aún cuando existen diversas hipótesis, recrudeciendo en los ultimos años la discusion entre quienes defienden la patogenia autoinmune y quienes atribuyen el daño a la accion directa del parásito. Sin embargo, cada vez resulta mas evidente el rol que tienen las CK en los mecanismos fisiopatogenicos.(Tarleton 1997). Como es sabido, la síntesis de estas moléculas a nivel local tiene efectos beneficiosos para el huésped; pero cuando esta producción no es regulada, y alcanzan elevadas concentraciones a nivel sistémico, generalmente resulta perjudicial, con pérdida de proteínas, hipovolemia, coagulación vascular diseminada y, en última instancia, shock seguida de muerte. En este sentido, se conoce que TNF-a e IL-6 desempeñan un rol importante como mediadores del shock en sepsis bacterianas, en fiebres hemorrágicas virales y en la patogenia de infecciones parasitarias como la malaria. (Tittus, et al. 1991, Wilson 1998)
En la infección experimental, hemos detectado un marcado incremento en la producción de TNF-a , IL-6 e IL-10 durante el período agudo, en forma paralela a la parasitemia y asociado a la muerte de los animales. Sin embargo, en el modelo desarrollado en nuestro laboratorio, la aplicación de un esquema de vacunación previa indujo una fuerte protección frente a la infección con T. cruzi, con bajas parasitemias, elevada sobrevida y un marcado descenso en la liberación sistémica de estas CK, cuyas concentraciones se acercaron a las de los animales sin infectar. En el caso de IL-10 la vacunación se asoció a niveles plasmáticos normales durante todo el curso del estudio.
La estrecha asociación observada entre síntesis incrementada de CK proinflamatorias, elevadas parasitemias y muerte de los animales sugiere que tales moléculas pueden estar involucradas en la patogenia de la enfermedad en este modelo. Estos resultados concuerdan con los de otros autores, como Truyens y col (1995), quienes demostraron que la caquexia asociada a la infección por T. cruzi está mediada por la elevada producción de TNF-a . Por otra parte, Chandrasekar y col (1996) detectaron una importante producción de CK proinflamatorias (IL-6, TNF-a , IL-1b ) en el miocardio de ratones infectados con T. cruzi, sugiriendo que la liberación exacerbada de estas moléculas pueden contribuir al daño celular en el tejido cardíaco.
En otros estudios realizados observamos que la síntesis de IFNg , CK tipo Th1 con actividad protectora, estuvo preservada en los animales inmunizados. Además concomitantemente, con la vacunación experimental se incrementó la síntesis de IL12, CK liberada por los macrófagos, que estimula la actividad lítica de las células NK y la producción de IFNg . (Meyer et al., 1997, Trinchieri, 1995). Tomados en conjunto, los resultados demuestran que la resistencia inducida por la vacunación experimental está claramente asociada a un perfil de CK favorable para la resolución de la infección
El efecto del tratamiento antiparasitario en la infección experimental es claramente demostrativo de la probable utilidad de la determinación plasmática de TNF e IL-6 como marcadores de eficacia terapéutica. En efecto, cuando el tratamiento se efectuó en forma controlada, y en dosis equivalentes a las utilizadas en humanos, no se detectaron parásitos circulantes en los animales y los niveles de las CK ensayadas se encontraron dentro de límites normales. En cambio, la administración incompleta de la droga, no eliminó las parasitemias y, consecuentemente, no redujo sustancialmente los niveles de CK proinflamatorias. Por otra parte, se confirmó lo observado con el modelo de vacunación, respecto a la asociación que existe entre bajas parasitemias, bajos niveles de IL-6 y TNF-a y resolución de la infección.
Con respecto a lo que ocurre en la infección humana, los resultados obtenidos al dosar TNF-a en niños chagásicos confirman lo observado a nivel experimental y, por otra parte, muestran que en la serie estudiada por nosotros, esta CK permanece moderadamente elevada en algunos pacientes que cursaban el período indeterminado. Si este hallazgo se confirma en mayor número de pacientes, podría tener potencial interés para determinar su asociación con la evolución clínica de la enfermedad. Actualmente nos encontramos analizando la relación entre los niveles de TNF-a y de sus receptores solubles, debido a la actividad moduladora de los mismos, que pueden neutralizar la acción inflamatoria de la CK, por lo cual se encuentran entre los potenciales candidatos terapéuticos para ser usados como "anticitoquina" en enfermedades infecciosas, autoinmunes y procesos tumorales (Olsson et al, 1993 ).
El incremento en los niveles plasmáticos de IL-2R, en los niños con infección aguda, ya observado en nuestro laboratorio (Moretti et al. 1994), puede explicarse por que este receptor es marcador de activación linfocitaria, y se conoce que el T. cruzi produce, durante las primeras fases de la infección una activación policlonal que, juntamente con la inmunosupresión, favorece su instalación y diseminación en el huésped (Montes et al 1996,1999).
En resumen, independientemente de la fuente de producción o la circunstancia en que se liberan las distintas CK, el estudio de las modificaciones que sufren estas moléculas a lo largo de un proceso infeccioso es de sumo interés. En efecto, estos hallazgos nos ayudan a comprender la forma en que actúa el sistema inmune como efector de la resistencia frente al T. cruzi, aportar al conocimiento de la fisiopatogenia de la enfermedad o, inclusive, predecir la evolución de la misma y evaluar la eficacia del tratamiento. En este sentido, como ha sido propuesto en sepsis bacterianas (Buck et al,1996, Moretti et al.2000), la medición de estas moléculas puede proveer una nueva herramienta de laboratorio, de utilidad clínica y epidemiológica en Enfermedad de Chagas.
Agradecimientos: Los autores agradecen la colaboración prestada por el Dr. Gustavo Barbieri, del Centro de Chagas y Patología Regional de Santiago del Estero, por la provisión de los sueros humanos empleados en el presente trabajo.
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