Triatominae: estructura poblacional y estudios de re-infestación.

Dujardin J. P.¹, Panzera F. ², Schofield C. J. ³

(1) IRD, UMR9926 IRD-CNRS, UR022, Montpellier, France.
(2) Instituto de Biología. Sección Genética Evolutiva. Facultad de Ciencias. Montevideo, Uruguay.
(3) LSHTM, London WC1 E7HT, UK

I. Estructura poblacional
No trataremos aquí de la estructura genética presentada por poblaciones perteneciendo a especies diferentes. La estructura poblacional se refiere solamente a las poblaciones de una misma especie.

I. 1. Definición
El estudio de la estructura de las poblaciones de un organismo examina la cuestión de saber si en la continuidad aparente de su distribución geográfica existen o no poblaciones físicamente aisladas entre ellas. Esto podría tener consecuencias importantes para las estrategias de control puesto que, debido a un riesgo menor de re-infestación en poblaciones aisladas, tales poblaciones tendrían una probabilidad mayor de permanecer "limpias" después del tratamiento. La estructura de las poblaciones frecuentemente se refiere a como el territorio de una especie se halla ocupado: en poblaciones geográficas espaciadas, en poblaciones contiguas, en poblaciones ininterrumpidas, etc. Se trata de conocer si el flujo génico recorre indiferentemente por todas estas poblaciones, o si esta geográficamente fragmentado. Se excluye aquí el caso de una especiación críptica afectando el flujo génico. En practica, un problema común es de saber si existen intercambios frecuentes de individuos entre ciertas poblaciones. Pero la estructura de las poblaciones no se relaciona solamente a la geografía (estructura espacial), se la puede examinar también con relación al tiempo, cuando se comparan generaciones diferentes (estructura temporal), o a otros parámetros, como por ejemplo ecológicos: existe una división natural entre poblaciones silvestres y domésticas de Triatoma infestans?

I. 2. Estructura poblacional y marcadores.

I. 2. 1. Marcadores genéticos.
De una manera rigurosa el estudio de la estructura de las poblaciones se basa en la estimación cuantitativa del flujo génico entre estas poblaciones, lo que brinda una información sobre el intercambio - presente, o pasado - de individuos entre estas poblaciones; o sea, una estimación indirecta de tasas de inmigración y/o emigración. Preferiblemente, el material genético estudiado debería ser de origen nuclear y no mitocondrial, puesto que en caso de ausencia de diferencias mitocondriales entre poblaciones habría que excluir la hipótesis de "introgresión"... repitiendo la comparación con marcadores nucleares. Idealmente, estos marcadores nucleares deberían ser "neutros" y "polimorficos".

I. 2. 1. 1. Marcadores "neutros".
Para permitir una estimación no sesgada del flujo génico entre poblaciones, el marcador genético tiene que evolucionar sin interferencia de la selección... tiene que ser "neutro", es decir no influenciado por el medio ambiente. Pero esta característica no es muy fácil de demostrar, y su validez es una mera hipótesis en la mayoría de los casos.

I. 2. 1. 2. Marcadores "polimorficos".
Un marcador "polimorfico" se refiere aquí de manera aproximada a una técnica capaz de revelar variaciones genéticas individuales. Entre los segmentos del ADN que tienen una tasa evolutiva diferente, los más "rápidos" son los más aptos en presentar variaciones individuales. Sin embargo, las predicciones generales no se aplican necesariamente a cada especie, y a la hora de seleccionar el marcador adecuado, la experiencia es lo que prevale. Por otra parte, puesto que la tasa de mutación en general es demasiado lenta como para interferir con la estructura poblacional, lo más importante es de contar con polimorfismo aun si el marcador tiene la reputación de ser "lento". Por ejemplo, la electroforesis de las isoenzimas no revela mucha variación individual dentro del grupo "prolixus" del genero Rhodnius (Harry et al., 1992; Dujardin et al. 1998a) y no se presta bien a los estudios poblacionales. Sin embargo, el mismo marcador fue muy informativo en el genero Triatoma (Breniere et al., 1998; Dujardin et al., 1998c; Noireau et al., 1999). Los dos marcadores con reputación de ser generalmente "rápidos", como RAPD o microsatélites, también permitieron revelar bastante polimorfismo (Carlier et al., 1996; Harry et al., 1998), pero relativamente menos que en otros insectos como ciertos dípteros.

I. 2. 1. 3. Tamaño poblacional efectivo
Cabe notar la sensibilidad de un marcador genético no es lo único que prevale en revelar una estructura poblacional, también influye el comportamiento reproductivo de las poblaciones del insecto. Así, cual sea el carácter, "lento" o "rápido", de un marcador genético, la detección de una estructura poblacional será mas evidente si el 'tamaño reproductor efectivo' de las poblaciones es pequeño (Dujardin et al., 2000). El 'tamaño reproductor efectivo' se refiere al numero de individuos efectivamente contributivos a la generación siguiente. Si son pocos los individuos que contribuyen a la generación siguiente, los efectos de la deriva genética serán más amplios y más rápidos, generando divergencias de frecuencias génicas, y por consecuencia estructura poblacional. Pero es difícil conocer este parámetro, el cual puede cambiar de una población a otra.

I. 1. 2. Marcadores fenéticos
Es muy probable que marcadores tales como las dimensiones externas (morfometría), o la cobertura antenal de microreceptores químicos y mecánicos, dos marcadores recientemente utilizados en el estudio de la estructura poblacional (Dujardin et al. 1997a; b; 1998a; b; 1999a; b; Catala & Dujardin 2001), no sean marcadores muy neutros. Los caracteres fenéticos, en particular los caracteres métricos, están por supuesto más influenciados por el medio ambiente, en particular durante el desarrollo del insecto del huevo al adulto. No obstante si se puede particionar la variabilidad métrica en sus componentes ambientales y genéticos, la morfometría puede ser informativa.

En efecto, el carácter métrico es de cambio "rápido", y su variación no depende solamente del medio ambiente, también esta bajo control genético. Según Falconer (1981), el rasgo métrico es el primero en cambiar, sea por razones ambientales o por deriva genética, en caso de aislamiento físico entre dos poblaciones. El contenido genético de la información métrica se puede verificar criando los especimenes comparados en un mismo ambiente. Así, la diferenciación métrica de las poblaciones "Norte" y "Sur" de Triatoma infestans en el Uruguay existe en las poblaciones naturales así como en sus replicas criadas en el mismo laboratorio (Casini et al. 1995), y persiste aun después de eliminar matemáticamente las diferencias de tamaño (Dujardin & Casini 1996b). La remoción del tamaño es un procedimiento buscando reducir la varianza ambiental de la heterogeneidad métrica.

I. 2. Estructura poblacional y tiempo.
La apariencia de la estructura genética no es necesariamente el efecto del flujo génico en el momento mismo del estudio, y el problema puede surgir de atribuir a los tiempos presentes o a una época pasada las diferencias aparentes - o su ausencia - entre poblaciones. Desde un punto de vista epidemiológico, no se quiere saber si las diferencias genéticas o fenéticas entre poblaciones se refieren a unos cambios ocurridos en el pasado, pero si se deben a una separación que existe ahora. Para responder a tal pregunta, una aproximación tradicional es el uso de "marcadores externos" (colores, etc.). Sin embargo esta técnica informa generalmente sobre los estados que se desplazan activamente, como adultos alados. En los Triatominae el modo principal de dispersión parece mas bien una dispersión pasiva de los estadios pre-imaginales (huevos, pequeñas ninfas). Las poblaciones silvestres y domésticas de T. infestans en Bolivia no muestran diferencias notables en la electroforesis de isoenzimas, lo que sugiere flujo génico, y por consecuencia intercambio de individuos, entre estos dos ecotopos (Dujardin et al. 1987). Sin embargo, suponiendo que las poblaciones domésticas aparecieron hace unos cuantos miles de años (Schofield 1988; 2000), es aceptable la hipótesis que en tan poco tiempo evolutivo, aún en el caso de aislamiento actual entre estos ecotopos, no se hayan instalado diferencias isoenzimaticas significativas. Así, mientras las isoenzimas permanecieron "mudas", tanto el RAPD como la morfometria mostraron diferencias significativas entre los ecotopos de T. infestans (Carlier et al. 1996, Dujardin et al. 1997a; b).

II. Un caso particular: los estudios de re-infestación.
Los estudios de re-infestación se pueden presentar como un caso particular del problema de la estructura poblacional, y por lo tanto se pueden estudiar con los marcadores genéticos y fenéticos. Lo particular del caso es que aquí en un mismo análisis se comparan poblaciones tanto en el espacio como en el tiempo.

II. 1. Re-infestación, definición.
Si las brigadas encargadas de la vigilancia entomológica (que sigue a la aplicación de insecticidas) pueden encontrar especímenes vivos del vector, en este caso una nueva aplicación del insecticida debe ser decidida.

Desde un punto de vista operacional se habla de "población residual" si la presencia de individuos vivos es detectada durante los primeros meses, se habla de re-invasión si ella es detectada después de tres años (si es que hubo vigilancia entomológica - activa o pasiva - durante estos tres anos, por supuesto). En el primer caso se supone que los individuos vivos fueron los que escaparon a la aplicación del insecticida. En el segundo caso se puede pensar en una invasión, pasiva o activa, a partir de focos vecinos no identificados. La distinción es importante porque de ella depende ampliar una nueva intervención en el sitio: limitada al pueblo, a un cuarto del pueblo, en caso de población residual o extenderse a lo pueblos vecinos en caso de "re-invasión".

En T. infestans, se ha mostrado que la electroforesis de isoenzimas o la morfometría pueden ayudar a la distinción entre las dos hipótesis.

II. 2. Re-infestación, metodología propuesta.
Se trata de comparaciones entre los individuos de re-infestación y de otros: los del mismo sitio antes de la aplicación del insecticida, y los de otros sitios (generalmente vecinos). El resultado permitirá proporcionar a los responsables de la lucha anti-vectorial una ayuda para su decisión (Schofield, 2001).

La comparación se hace o sea entre los reinfestantes y la "población inicial", antes de un tratamiento, sea entre las poblaciones reinfestantes y las "poblaciones vecinas", o sea bien entre todos estos grupos si es posible. Para comprender este método, nosotros definiremos los grupos comparados de la manera siguiente:

I = Población inicial antes de la aplicación del insecticida
V = Población(s) vecina(s)
R = Población de re-infestación (de "re-invasión")
Si I = R y R <> V, se concluye que es una población residual;
Si I <> R y R = V, Se concluye que es una re-invasión (a partir de V);
Si I <> R y R <> V, Se concluye que es una re-invasión de origen desconocido;
Si I = R y R = V, no se concluye nada.

Desde un punto de vista conceptual, se podría imaginar una diferencia entre I y R donde R sería una población residual, diferencia debida a la deriva genética a partir de algunos sobrevivientes. Pero la deriva génica demanda en general mas que una generación para producir sus efectos: como el ciclo de los Triatominae es largo, en general de muchos meses, y que las re-infestaciones son detectadas generalmente algunos meses después del tratamiento, las comparaciones se hacen generalmente al interior de una generación.

Este ejercicio puede realizarse sobre la base de una variación isoenzimática o métrica porque T. infestans suele presentar una estructuración importante de sus poblaciones, conduciendo a las diferencias microgeográficas a menudo significativas.

Una comparación estadística entre dos grupos supone generalmente haciendo una estimación aceptable de sus variaciones internas (la varianza). En general, los especimenes de re-infestación son poco numerosos y la estimación de su variación puede estar desviada. Pero el objetivo del estudio esta en verificar si estos especimenes (R) provienen de otra población (I o V). Nosotros proponemos ignorar la varianza de la población de re-infestación y de utilizar en las comparaciones la varianza de la población de origen supuesto (I o V) (Dujardin et al. 1996a).

Sobre la base de las frecuencias alélicas, las comparaciones miden el riesgo de error rechazando una población candidata como fuente de re-infestación. Sobre esto se puede asociar a las conclusiones un riesgo de error. En morfometría no podemos llegar a tal exactitud, nos contentamos de evaluar la similitud de las poblaciones comparadas: un árbol de clasificación incluye a los re-infestantes (R), es factible entonces indicar su aparente fuente (I o V).

II. 3. Re-infestación, ejemplos.
Tres estudios publicados pueden ser mencionados que utilizaron este método, una basada sobre las isoenzimas en la región de Vallegrande (Dujardin et al. 1996a), la segunda basada sobre la morfometría en la región de los focos silvestres de Bolivia (Dujardin et al. 1997b) y la tercera combinando isoenzimas y morfometría en la provincia de Cordillera (Bolivia) (Dujardin et al. 1999b). Los dos primeros estudios concluyen hacia una población residual, el tercero a una re-invasión a partir de focos vecinos.

Los resultados del segundo estudio (Dujardin et al. 1997b) apoyan la hipótesis de un aislamiento actual (quizás no fue así antes) entre ecotopos silvestres y domésticos de T. infestans en Cochabamba, reduciendo así la importancia epidemiológica exagerada que se atribuyó a estos focos silvestres.

Dentro del tercer estudio es notable constatar la similitud de las informaciones proporcionadas por la morfometría y la electroforesis de isoenzimas (Dujardin et al. 1999b). La figura de más abajo muestra los resultados de este estudio de la provincia Cordillera utilizando a la vez isoenzimas y morfometría. La figura presenta un mapa factorial de los factores discriminantes (FD) de la variación de la forma independiente del tamaño en las hembras con la probabilidad de error rechazando I o V como fuente de re-infestación. Esta probabilidad es deducida de las comparaciones entre los mismos grupos de las frecuencias alélicas derivadas de la electroforesis de isoenzimas. Las poblaciones hembras I,V y R son representadas por un circulo de confianza (95%). El mismo resultado se verifico para los machos (no se muestra).

Un estudio no publicado, mencionado en Dujardin et al. (2000), hizo uso de la variación cromosómica de Triatoma infestans. En Uruguay (Sexta Seccional de Tacuarembó), entre 1992 y 1994, los perfiles cromosómicos de los individuos re-infestantes no difirieron de aquellos que caracterizaban a las poblaciones tratadas, mientras que las poblaciones vecinas presentaban patrones cromosómicos distintos. Estos resultados (Panzera, no publicados) se pueden resumir como: I = R y R <> V, y por consecuencia sugieren que las re-infestaciones en Uruguay surgieron a partir de individuos residuales, no afectados por los tratamientos anteriores.

Fig.- Estudio isoenzimático y morfométrico de la re-infestación por T. infestans en la provincia Cordillera (Bolivia). FD1 y FD2, primera y segunda función discriminante. Entre paréntesis su representatividad, es decir la proporción de la varianza total que representa cada función discriminante. I, población inicial antes de la aplicación del insecticida; V, población (es) vecina (s); R, población de re-infestación; P, riesgo de error en el rechazo de I o V como fuente posible de re-infestación, estimada sobre la base de las diferencias de frecuencias alélicas entre poblaciones (electroforesis de isoenzimas, ver Dujardin et al., 1996a). Estudio en colaboración con el CENETROP (Santa Cruz de la Sierra, Bolivia).

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