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Inmunoprotección Experimental

Esteva Mónica, Gabriela García

Instituto Nacional de Parasitología "Dr. Mario Fatala Chabén". ANLIS Malbrán.
Av. Paseo Colón 568. (1063). Buenos Aires, Argentina.

La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis americana es una parasitosis producida por Trypanosoma cruzi que se extiende desde el México hasta aproximadamente el paralelo 42 de latitud sur en la Argentina y Chile. Existen en América Latina aproximadamente 16 millones de infectados y decenas de miles bajo riesgo de infección, especialmente en las áreas más carenciadas y rurales, caracterizadas por viviendas humildes que favorecen el alojamiento de los insectos vectores de Trypanosoma cruzi [WHO, 1991]. La principal vía de transmisión del T. cruzi es el contacto directo con el vector que constituye la vía natural, otras vías de transmisión son, la congénita, por transfusión de sangre, por transplantes de órganos y por accidentes de laboratorio. El principal vector de T.cruzi en el Cono Sur es el Triatoma infestans [Klug 1834] (Heteroptera, Reduviidae), insecto hematófago que comparte la vivienda humana.

El control de la transmisión de T. cruzi, se realiza principalmente mediante el control de las poblaciones del vector, el control de la sangre a transfundir y de los transplantes de órganos y el siguimiento del hijo de madre chagásica. La disminución de la prevalencia de la infección y la disminución o desaparición en algunas áreas de casos agudos, señalan que en la Argentina y en otros países del Continente, luego de casi 40 años de actividad de los programas, es factible el control de la transmisión del T. cruzi [Segura y col., 1999]. En esta nueva realidad epidemiológica sostenemos que es necesario plantear otras alternativas, como el desarrollo de vacunas y el empleo de quimioterápicos efectivos, para lograr la prevención de nuevos casos. Así las investigaciones para desarrollo de una vacuna que en otro momento hubiera sido inaplicable, frente a una transmisión vectorial activa y masiva deberían hoy ser nuevamente consideradas teniendo en cuenta la actual situación del aporte parasitario en la naturaleza.

Una vacuna debería generar una respuesta inmune que no permita el inicio de la infección por T.cruzi. Debería resolverse el problema de la inocuidad de la misma para los tejidos del huésped y estar constituida por antígenos definidos químicamente [Ruiz y col., 1994]. Otro enfoque del desarrollo de vacuna es la prevención de la lesión o la evolución hacia la forma crónica de la infección.

Con el fin de producir una respuesta inmune protectiva contra la enfermedad de Chagas ante el desafio con formas virulentas del parásito se han utilizado diversas técnicas que abarcan desde parásitos atenuados en su virulencia hasta la inmunización génica. En nuestro laboratorio se han desarrollado estudios sobre antígenos de T. cruzi y la respuesta inmune obtenida con los mismos, en una variada gama de aspectos. Segura y col., 1976, trabajaron con fracciones subcelulares de epimastigotes obtenidas a partir de centrifugación diferencial en gradientes de densidad de sacarosa. La fracción flagelar, enriquecida en flagelos y membranas, liofilizada y asociada a Bordetella pertussis como adyuvante, se inoculó a ratones. Esta fracción indujo una importante protección en ratones BALB/c, frente a un desafío con formas infectantes del parásito. Sólo el 40% de los animales desafiados mostraron parasitemia detectable [Ruiz y col., 1986]. Esta protección se observó en términos de mortalidad, parasitemia y patología, cuando se utilizó un modelo murino de la enfermedad crónica, no se detectó en estos animales indicio de alguna alteración patológica por la inoculación de este inmunógeno [Ruiz y col., 1985]. Esta observación es de suma importancia teniendo en cuenta la presunta existencia de reacciones cruzadas entre los antígenos del T. cruzi y del huésped y las lesiones observadas en los tejidos de los animales inmunizados con otros componentes que causan agresión en ausencia de infección. [Ruiz y col., 1985; Teixeira y col.,1975].

La producción de anticuerpos monoclonales y los avances en los métodos de obtención de proteínas permitieron mejorar la identificación, aislamiento y purificación de proteínas definidas del parásito. Numerosos son los trabajos que utilizan proteínas del parásito purificadas para pruebas en esquemas de inmunoprotección. Algunas de las utilizadas fueron: glicoproteínas de superficie de peso molecular de 72 kDa que protegieron animales contra un desafío con tripmastigotes metacíclicos pero no contra un desafío con tripomastigotes sanguíneos [Snary y col., 1981], indicio importante que los tripomastigotes metacíclicos son vulnerables a los mecanismos del sistema inmune del ratón [Snary, 1983]. Otra glicoproteína, de peso molecular 90 kDa, que no cruza con tejidos de mamíferos [Scott y col., 1982], indujo protección y mayores niveles de reacción de hipersensibilidad retardada cuando se utiliza saponina como adyuvante [Scott y col., 1984], pero no produjo negativización de la parasitemia, luego de un desafío con parásitos en ratones y monos [Scott y col., 1984 y 1985].

Una glicoproteína de similar peso molecular pero presente solamente en tipomastigotes metacíclicos fue mencionada como inductora de resistencia contra la infección aguda generando una respuesta inmune protectora satisfactoria [Yoshida y col., 1990]. También se utilizaron antígenos purficados de anticuerpos monoclonales [Gomez y col., 1995] y proteínas purificadas a través de columnas de afinidad [Plumas-Marty y col, 1993]. En nuestro laboratorio se generaron varios anticuerpos monoclonales contra la fracción flagelar [Segura y col., 1986]. Uno de ellos, FCH-F8-4, fue estudiado en profundidad [Ruiz y col., 1990]. El Ag4 reconocido por este anticuerpo está presente en la superficie de tripomastigotes. Posteriormente a una incubación con FCH-F8-4, tripomastigotes sanguíneos inoculados en ratones sufrieron una neutralización parcial de su capacidad infectiva y presentó actividad lítica mediada por complemento sobre tripomastigotes de cultivo. Por cromatografía de afinidad con el FCH-F8-4 se purificaron los antígenos de epimastigotes. En experimentos de inmunoprotección, ratones inmunizados con Ag4 purificado fueron desafiados con 103 tripomastigotes metacíclicos de la cepa Tulahuén. Sólo el 40% presentó parásitos en sangre (100% en controles) y la parasitemia bajó el 90% respecto a los controles. La sobrevida fue del 100% hasta los 40 días post infección (60% en controles). El anticuerpo FCH-F8-4 se utilizó para detectar clones en una biblioteca de expresión y con la información obtenida a partir de la secuencia de estos clones de ADN, se prepararon péptidos sintéticos. Uno de ellos, denominado SP4, inhibió en ensayos inmunoenzimáticos la reactividad sobre epimastigotes de sueros de ratones inmunizados con epimastigotes. Los ratones inmunizados con SP4 y B. pertussis como adyuvante mostraron una respuesta de anticuerpos y celular contra el parásito, indicando que que el péptido adopta una conformación similar a la presente en la superficie del parásito.

Otra estrategia utilizada para la identificación de componentes protectores fue el estudio de productos de excreción - secreción del parásito [Ouassi y col., 1990] postulándose que estos antígenos podrían intervenir en mecanismos de escape utilizados por el parásito para eludir la respuesta inmune [Taibi y col., 1993]. Su utilización como inmunógeno podría inducir una respuesta capaz de anular el desarrollo de estos mecanismos evasivos, aumentando de esta manera la acción del sistema inmune para controlar la infección.

La utilización de antígenos definidos purificados a partir del T. cruzi es mas conveniente y aceptable pero tiene la desventaja de su difícil obtención en volúmenes necesariospara realizar los estudios. La obtención de antígenos por técnicas de biología molecular y de ADN recombinante permitieron clonar, expresar y producir los antígenos de T. cruzi. A fines de los años 80 comienza la identificación de antígenos mediante rastreo de genotecas del parásito con sueros de pacientes infectados [Ibañez y col., 1987]. Las proteínas mas inmunogénicas poseen repeticiones de aminoácidos en su extremo C-terminal [Ibañez y col., 1988] y se encuentran principalmente en las formas del parásito presentes en el hospedador mamífero [Souto-Padrón y col, 1989]. Estos antígenos se clasifican dentro de una superfamilia llamada Superfamilia de Antígenos de Superficie de Tripomastigotes o también Superfamilia de las Trans-sialidasas (que cataliza la transferencia de ácido siálico de los glicoconjugados del huésped a la superficie del parásito) [Campetella y col.,1992; Sckenkman y col.,1994]. La mayoría de sus miembros se encuentran en la superficie de la membrana plasmática de tripomastigotes sanguíneos y metacíclicos y en amastigotes. Varios integrantes de esta superfamilia: SAPA ("shed acute phase antigen"), el dominio catalítico de la trans-sialidasa (TS) y la región amino de TSA-1("trypomastigote surface antigen-1"), fueron expresados en sistemas bacterianos y ensayados en experimentos de inmunoprotección. Estos antígenos recombinantes indujeron buenos títulos de anticuerpos dirigidos contra la región C-terminal de las proteínas pero no protegieron contra una infección por el T.cruzi [Chuenkova y Pereira, 1995]. Cuando se utiliza para inmunizar ratones sólo la región C-terminal del TSA-1 éstos no sobreviven al desafío, pero si se utiliza la porción N-terminal del antígeno se observa protección moderada [Wrighstman y col., 1994]. Se observó que la respuesta inmune protectiva del TSA-1 es mediada por células porque al realizar la transferencia adoptiva de células productoras de IFN-g y TNF-a a ratones naive éstos sobrevivían a la infección [Wizel y col., 1997], además la inmunización con SAPA recombinante disminuyó la parasitemia y la mortalidad después del desafío con respecto a los animales controles, protección mediada por células, no por anticuerpos [Nasser y col., 1997].
En nuestro laboratorio el efecto sobre animales de la proteína recombinante EP46/9 expresada en el plásmido pGEX1 y conformada por Tirosina Aminotransferasa (TAT) del parásito, proteína de 46 kDa involucrada en reacciones de gluconeogénesis y la glutation-S-transferasa de Schistosoma japonicum, también presente en la superficie del parásito, observándose protección parcial. Otros componentes de la fracción flagelar han sido identificados, clonados y caracterizados y han mostrado propiedades protectivas parciales cuando se utilizaron como inmunógenos en inmunización experimental, como la proteína flagelar ligadora de calcio (F29) [Porcel y col., 1993; Esteva y col., 1995]. Esta proteína se encuentra en el flagelo de Trypanosoma cruzi [Engman y col., 1989 y Ouaissi y col., 1992] y otros tripanosomátidos [Maldonado y col., 1997; Lee y col., 1990 y Porcel y col., 1996]. Es una proteína de la familia de las "calcium-acyl switch protein", liproteínas cuya asociación con la membrana es modulada por su estado de unión al calcio [Maldonado y col., 1999 y Godsel y col., 1999]. Dicha proteína se expresa en el tripomastigote (el estadio infectivo de T. cruzi) y es altamente inmunogénica [Porcel, Tesis Doctoral, 1996]. La expresión del gen completo que codifica para la proteína flagelar F29 en el vector pMAL-p2 permitió obtener una proteína recombinante fusionada a proteína de unión a maltosa. Cuando se ensayó la inmunogenicidad del antígeno recombinante F29-MBP, en ratones de la cepa BALB/c utilizando Bordetella pertussis como adyuvante, se observó que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune humoral contra el T. cruzi, demostrada por anticuerpos dirigidos contra la proteína pura y el homogenato total del parásito [Porcel y col., 1993]. La inmunización de ratones con la proteína de fusión bgal-F29 en presencia de Bordetella pertussis como adyuvante mostró una disminución de la parasitemia y un aumento de la sobrevida respecto a los animales controles. [Esteva y col., 1995].

Debido a sus características antigénicas, la proteina F29 ha sido utilizada en diagnóstico serológico para monitorear la evolución del paciente, después del tratamiento específico [Godsel y col., 1995; Krautz y col., 1995 y Sosa Estani y col., 1998]. Además la proteína F29 tiene un alto grado de homología con otras proteínas flagelares que ligan calcio y que se ubican en la superficie del parásito y en su bolsillo flagelar. [Porcel y col., 1993].

Las vacunas de ADN o inmunización plasmídica o genética constituyen una nueva forma de expresar antígenos "in vivo" para generar una respuesta inmune humoral como celular. La inmunización se realiza con un ADN plasmídico que codifica el gen que interesa y que es liberado directamente a las células del organismo a ser inmunizado, este ADN es tomado y expresado por las células del huésped y la expresión de este inmunógeno "extraño" induce una respuesta inmune. Algunas de ellas probaron inducir inmunidad celular y humoral de larga duración. Las vacunas de ADN son fáciles de producir, baratas, no exigen complejos procesos de purificación, no pueden revertir a productos patogénicos y son estables frente a la temperatura, no exigiendo cadena de frío. Un cúmulo de trabajos han demostrado que las vacunas de ADN pueden producir respuesta inmune humoral y mediada por células, las que a menudo proveen inmunidad protectora. Hasta el momento no se han reportado desventajas referidas al tema seguridad, aunque se plantearon los riesgos de: integración del ADN al cromosoma de la célula huésped, producción de anticuerpos anti-ADN, y la posibilidad de generar tolerancia inmunológica [Hassett,1996].

Varios vectores eucarióticos han sido usados con éxito para construir vacunas de ADN y están comercialmente disponibles. Las principales diferencias consisten en la variedad de sitios de restricción en el polilinker, la co-expresión de moléculas que estimulan a las células presentadoras de antígenos, y finalmente la presencia de un péptido líder que obvia la necesidad de insertar el gen completo con su codón de iniciación, al mismo tiempo que produce la secreción de la proteína sintetizada. La producción de la proteína por el aparato biosintético de la célula huésped garantiza todas las modificaciones propias de las células eucarióticas, muchas de las cuales (glicosilación, enlaces disulfuro, etc) pueden jugar un papel importante en términos de exposición de grupos químicos generadores de respuesta inmune. Los métodos de liberación del ADN plasmídico son varios siendo los sitios de inoculación la piel y el músculo: la inmunización intramuscular (i.m), la inmunización intradérmica , la inmunización mediada por partículas ("pistola genética") y la utilización de liposomas. Varias estrategias han sido empleadas para aumentar la eficiencia de la transferencia de ADN por vía i.m., una de ellas es la regeneración de las fibras musculares que han sido dañadas por el anestésico local bupivacaina. No sabe si la mayor eficiencia lograda con este método se debe a la fragilidad de las membranas de las células musculares, o al aumento de células presentadoras de antígeno debida al trauma. También es importante que la inoculación se realize en forma paralela a la fibra muscular. Otros factores como el tipo de aguja, velocidad de inoculación, volumen del fluido inyectado, tipo de músculo, edad y sexo del animal inyectado, pueden influir en la expresión del ADN plasmídico.

La técnica de vacuna de ADN ha sido evaluada en diversas infecciones parasitarias producidas por protozoos [Alarcon y col., 1999]. Se han obtenido buenas respuestas de anticuerpos e inmunidad protectiva contra antígenos de Leishmania major [Gurunathan, 1997], Plamodium yoelii [Sedegah y col., 1994; Taubes, 1997] y Toxoplasma gondii [Nielsen y col., 1999]. En cuanto a Trypanosoma cruzi, se han utilizado para la inmunización de ratones de diferentes cepas, genes que codifican para dos antígenos pertenecientes a la superfamilia de antígenos de superficie de tripomastigotes [Campetella y col., 1992]: la transialidasa (dominio catalítico) y el antígeno de superficie de tripomastigote 1 (Trypomastigote Surface Antigen 1, TSA-1), pertenecientes al grupo I y II de esta superfamilia, respectivamente [Cross, 1993]. El antígeno TSA-1 es uno de los blancos de los linfocitos T citotóxicos CD8+ en la infección humana y experimental [Wizel y col., 1997; Wizel y col., 1998a] siendo utilizado este antígeno en inmunización génica. Se obtuvo inducción de anticuerpos, citotoxicidad mediada por linfocitos T(CD8+) y protección parcial luego del desafío con T. cruzi [Wizel y col., 1998 b]. Resultados similares se obtuvieron cuando se utilizó como inmunógeno la porción catalítica de TS [Costa y col., 1998]. Las células CD4+ y CD8+ que se producen luego de inmunizar animales con este antígeno secretan IFN-g pero no IL-4 o IL-10 y también se observó que inhiben la replicación intracelular del T.cruzi [Rodrigues y col., 1999]. También se observó que la inmunización con un plásmido codificando para epitopes CD4+ y CD8+ de TS produjo un efecto similar a la del plásmido conteniendo el dominio catalítico de la TS [Fujimura y col., 2001].

La respuesta inmune puede ser regulada asociando diferentes citoquinas a la inmunización plasmídica. La inoculación de plásmidos codificando tanto para IL-12 o IFN-g aumentan la respuesta tipo Th1, pero la inoculación de IL-4 incrementa la respuesta Th2 [Chow y col., 1998]. La inoculación de proteínas flagelares (paraflagellar rod protein) associada adenovirus recombinantes que contienen el gen de IL-12 mostró una fuerte respuesta de tipo celular y un 90 % de reducción de la parasitemia [Wrightsman y Manning, 2000].

En nuestro laboratorio se evaluó la respuesta inmune en ratones inducida por la inoculación de un plásmido de expresión que contiene la secuencia codificante para una proteína de T. cruzi : PHGST #5 (un miembro de la familia Tc13, perteneciente a la superfamilia de antígenos de superficie del tripomastigote). Dicho clon fue seleccionado en una genoteca de Trypanosoma cruzi construída en el vector lambda ZapII con un suero de conejo anti-glutation-S-transferasa de Schistosoma japonicum [García y col., 1997]. El clon PHGST V codifica para una proteína de alto peso molecular que posee en su extremo carboxi-terminal al menos 45 repeticiones de cinco aminoácidos (EPKSA), característicos de la familia Tc13, formando parte del grupo IV según Cross y col., y demostró tener alta homología con miembros de la superfamilia de antígenos de superficie de tripomastigotes (en secuencia de aminoácidos el porcentaje de identidad fue mayor al 60 % con miembros de esta superfamilia).

La superfamilia de antígenos de superficie se caracteriza por tener en su secuencia hasta cuatro copias del motivo de aminoácidos Ser-X-Asp-X-Gly-X-Thr-Trp muy conservado en neuraminidasas bacterianas [Campetella y col., 1992]. Algunas familias de esta superfamilia presentan zonas de repeticiones en tandem en su extremo C-terminal que son blanco de la respuesta inmune del hospedador. Una de ellas es la familia de SAPA (shed acute phase antigen) [Affranchino y col., 1989; Pollevick y col., 1991] cuyos miembros demostraron poseer en su N-terminal la mayoría de la actividad neuroaminidasa y transialidasa del parásito [Parodi y col., 1990].

La evaluación del PHGST V en ensayos de inmunización resulta interesante ya que por homología de secuencia podríamos suponer que se encuentra en la superficie de la forma tripomastigote del parásito y pertenecería a una superfamilia que se caracteriza por ser blanco de la respuesta inmune del hospedero mamífero. Existe un antecedente de vacuna de ADN con un miembro de esta superfamilia, ratones inmunizados con vectores conteniendo la transialidasa demostraron montar una respuesta humoral y celular contra esta proteína, así como una disminución de la parasitemia cuando los animales son desafiados con tripomastigotes sanguíneos [Costa y col., 1997]. Esta secuencia fue clonada en el vector pcDNA 3.1(+). Luego de confirmar la expresión de PHGST#5 en sistemas eucariotas "in vitro" e "in vivo" se inmunizaron ratones hembras de seis semanas de la cepa BALB/c con pcDNA-PHGST#5 o pcDNA sin inserto (cuatro dosis de 50ug de plásmido/dosis/ratón por vía intramuscular en el músculo tibial anterior), con el objeto de estudiar la respuesta inmune producida por la inmunización y la inmunoprotección ante el desafío con formas infectantes del parásito. La sobrevida fue del 100 % en los grupos inmunizados con pcDNA-PHGST#5 o pcDNA y del 80 % en el control sin inmunizar. La inmunización no desencadenó una respuesta específica de anticuerpos evaluada por enzimoinmunoensayo contra PHGST #5 recombinante y se detectó una leve respuesta de DTH contra la proteína recombinante. Se observó una reducción significativa de la parasitemia post-desafío con formas infectantes del parásito. [Tesis Doctoral Gabriela García, 2001]. La reducción de la parasitemia de los ratones inmunizados con pcDNA comparada con el grupo control sin inmunizar, puede ser atribuída al efecto adyuvante que presentan los motivos CpG que están presentes en el ADN plasmídico y se conoce que los CpG favorecen la secreción de citoquinas de tipo Th1 [Chu y col., 1997], las cuales juegan un rol importante en la resistencia a la infección [Zhang y Tarleton, 1996]. La inmunización plasmídica produjo una disminución de la inflamación y parasitismo tisular en miocardio y músculo esquelético [Gabriela García,Tesis Doctoral, 2001]. La inducción de anticuerpos específicos por la inoculación plasmídica de miembros de la superfamilia de antígenos de superficie demostró tener relación con la cepa de ratón utilizada y con la presencia o nó de las repeticiones C-terminales en la proteína expresada [Wizel y col., 1998; Pereira-Chioccola y col., 1999]. Estos resultados preliminares alientan el estudio de la respuesta celular e inmunoprotectiva en ratones inmunizados con pcDNA PHGST # 5 dados los buenos antecedentes existentes con otros miembros de la misma superfamilia evaluados por otros autores.

Se ha logrado protección parcial en la mayoría de los casos, los resultados alientan a continuar con la inmunización plasmídica para el desarrollo de una vacuna contra la infección por T. cruzi o de una vacuna terapéutica .


Referencias

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