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Nuevas drogas para el tratamiento etiológico
de la Enfermedad de Chagas

Julio A. Urbina, Ph.D.

Laboratorio de Química Biológica, Centro de Biofísica y Bioquímica,
Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas,
Caracas, Venezuela.


Resumen
En este trabajo se presenta una revisión crítica del status actual y nuevas perspectivas en el tratamiento etiológico de la enfermedad de Chagas. Se discute primero la relevancia del tratamiento etiológico en el manejo del paciente con esta dolencia y se concluye que, después de una prolongada controversia sobre el posible origen autoimmune de las manifestaciones patológicas de esta enfermedad (particularmente en su fase crónica), hay actualmente un creciente consenso de que la erradicación del Trypanosoma cruzi es un requisito indispensable para evitar el desarrollo de dichas manifestaciones. Para este fin, los tratamientos actualmente disponibles (nifurtimox, Bayer; benznidazol, Roche) presentan serias deficiencias, particularmente por su muy baja eficacia en el tratamiento de las infecciones crónicas y sus frecuentes efectos colaterales. Por otro lado, la importante acumulación de conocimientos sobre la fisiología y bioquímica del T.cruzi está abriendo perspectivas para el desarrollo racional de nuevos enfoques terapéuticos específicos. Entre estos enfoques, los inhibidores de la biosíntesis de ergosterol con acción potente y selectiva contra el parásito y propiedades farmacocinéticas especiales (ej.: posaconazol, Schering-Plough) son actualmente los mejores candidatos para un nuevo tratamiento específico de esta parasitosis, tanto en fase aguda como crónica. Otros enfoques promisorios incluyen inhibidores de la cruzipaína (una proteasa dependiente de cisteína, esencial para la supervivencia del T.cruzi), del metabolismo del tripanotión (análogo del glutatión, solo presente en tripanosomatideos), de la biosíntesis de fosfolípidos y ácidos nucleicos (captura y metabolismo de purinas), así como del metabolismo de polifosfatos e inositol en este parásito.

Introducción
La enfermedad de Chagas, causada por el protozoario patógeno Trypanosoma cruzi es una antropo-zoonosis que constituye la mayor carga parasitaria del continente Americano: hay 16-18 millones de personas ya infectadas en América Latina y cerca de 100 millones (25% de la población del sub-continente) expuestas al riesgo de infección [1-3]. Se ha estimado que esta dolencia parasitaria es responsable de la perdida de aproximadamente 3 millones de años efectivos laborables por morbilidad y 50.000 muertes cada año [2,3]. Aunque han habido recientemente importantes avances en el control de la transmisión vectorial y transfusional de esta enfermedad, particularmente por la iniciativa del Cono Sur [2,3], lamentablemente la transmisión continúa en otras partes del continente y la situación de los pacientes ya infectados, en su gran mayoría en la fase crónica de la enfermedad, constituye un gran reto social y científico para todos los países del continente. Esto incluye a los Estados Unidos de América, hacia donde emigran anualmente miles de latinoamericanos, muchos de ellos portadores del parásito [4-6].

La relevancia del tratamiento etiológico en el manejo del paciente con enfermedad de Chagas
Aunque la participación del T.cruzi en la patología de la forma aguda de la enfermedad de Chagas es ampliamente aceptada [7-9], su papel en la patogénesis de la fase crónica ha sido motivo de intensos debates [9-11]. Numerosos estudios han sugerido que las alteraciones fisio-patológicas características de esta etapa de la enfermedad, incluyendo la miocardiopatía chagásica, son resultantes de fenómenos autoimmunes producto de la reactividad cruzada entre antígenos parasitarios y ciertos componentes claves del hospedero vertebrado [9,10]. Según esta hipótesis, luego de instalado el proceso autoimmune, la persistencia del parásito en el organismo infectado no tendría un papel determinante en el desarrollo de la patogénesis de la enfermedad y por ende aun un tratamiento etiológico exitoso no podría evitar el desarrollo de las lesiones terminales características de la enfermedad [9,10].

Sin embargo, esta conclusión ha sido cuestionada por los resultados de estudios recientes [5,6,9,11] que demuestran:

1. La persistencia del parásito en las lesiones inflamatorias características presentes en pacientes con miocardiopatía chagasica o megasíndromes del tracto gastro-intestinal, corroborada usando técnicas de alta sensibilidad como la reacción de polimerasa en cadena (PCR) e immunofluorescencia.
2. La naturaleza heterofílica de los "auto-anticuerpos" reportados en animales experimentales o pacientes con enfermedad de Chagas crónica y la falta de correlación entre su presencia y la patología especifica de la enfermedad.
3. Efectos positivos de la quimioterapia especifica en la evolución clínica de la enfermedad experimental y humana.

En resumen, resultados acumulados indican que la presencia del T.cruzi es una condición necesaria y suficiente para el desarrollo de la lesiones características de la enfermedad de Chagas crónica, tanto en animales como en humanos y que la erradicación del parásito es un prerequisito para evitar la evolución a las formas terminales de la enfermedad [5,6,11-15]. Referimos al interesado a Tarleton [16] quien ha hecho recientemente una discusión profunda sobre el tema, concluyendo en que la enfermedad debe ser tratada como una infección y no un problema autoimmune, lo que tiene importantes consecuencias en el manejo del paciente infectado con T.cruzi, así como en la planificación y financiamiento de la investigación sobre esta patología.

Enfoques quimoterapeuticos específicos disponibles actualmente para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y sus limitaciones.
Hasta el momento, las únicas drogas disponibles para el tratamiento etiológico de la enfermedad de Chagas son nitrofuranos (nifurtimox, Bayer, recientemente discontinuado) y nitroimidazoles (benznidazol, Roche). Ambos compuestos fueron introducidos empíricamente en las décadas de los 60 y 70 del siglo pasado: hoy en día se conoce que actúan por vía de la generación de radicales libres, a lo cual los parásitos tripanosomatídeos son particularmente sensibles por su limitada capacidad de detoxificación [17,18].

La experiencia de varias décadas ha demostrado que ambas drogas tiene una significativa actividad en la fase aguda de la enfermedad (hasta un 80% de éxito terapéutico [19]), aunque su eficacia varia según la región geográfica de procedencia del paciente, probablemente debido a diferencias en la susceptibilidad intrínseca de diferentes cepas del T.cruzi [19-21]. Otro importante resultado, obtenido en la última década, es que estos compuestos también tienen capacidad curativa la fase crónica temprana (con pocos años de desarrollo, típicamente pacientes pediátricos o juveniles luego de superada la fase aguda) alcanzándose hasta un 60% de cura parasitológica, definida por negativización completa de las pruebas parasitológicas y serológicas [22], en estudios realizados en Argentina y Brasil [13-15]. Sin embargo, estudios recientemente publicados por Silveira y colaboradores [23], discrepan con esta conclusión al demostrar que en un grupo de niños de 7 a 12 años de edad en fase crónica de la enfermedad tratados con nifurtimox y/o benznidazol y seguidos por 8-20 años solo 1 de 12 (8.3%) presento cura parasitológica y clínica. Mas serio aun, es el elevado porcentaje (33%) de los niños tratados que progresaron a cardiomiopatía de segundo grado y/o megaesofago [23]. En base a esos hallazgos, los autores recomiendan estudios con números mayores de pacientes y seguimiento prolongado para establecer con certeza la eficacia de los nitrofuranos y nitroimidazoles en la fase crónica temprana de la enfermedad de Chagas. El benznidazol también se ha demostrado efectivo el tratamiento específico de infecciones por T.cruzi reactivadas como consecuencia de inmunosupresión, en pacientes con HIV-SIDA o sometidos a terapia inmunosupresora asociada a transplantes de órganos [24-26]. Sin embargo, recientemente ha se cuestionado la indicación este compuesto como terapia quimioprofiláctica primaria en pacientes immunosuprimidos con enfermedad de Chagas subyacente, al no haberse aun realizado ningún estudio clínico controlado sobre esta aplicación [27].

La mayor limitación de los nitrofuranos y nitroimidazoles en la terapia específica de la enfermedad de Chagas es su muy limitada eficacia en pacientes en su fase crónica (indeterminada o sintomática), que es la presentación clínica mas frecuente actualmente en Latinoamérica [2,3]. En estos pacientes el porcentaje de fracasos terapéuticos con benznidazol es típicamente 80% [19,20,22,28]. La actividad de este tipo de compuestos en pacientes en fase aguda y su muy limitada eficacia en la fase crónica ha sido confirmada recientemente en dos recientes estudios [29,30]. En el segundo estudio, Braga y colaboradores evaluaron, usando métodos de PCR cuantitativo, la carga parasitaria en pacientes crónicos tratados con nifurtimox o benznidazol o no tratados y no encontraron diferencias significativas entre los grupos experimentales [30]. Sin embargo, deben señalarse los resultados del importante estudio realizado por Viotti y colaboradores [12] en Argentina que indican que el tratamiento con benznidazol en pacientes crónicos, aunque incapaz de inducir cura parasitológica, conlleva a una significativa reducción en la ocurrencia de cambios electrocardiográficos y a una menor frecuencia de deterioro de la condición clínica de los pacientes. Tales resultados fueron interpretados en base a una probable una reducción de la carga parasitaria en los pacientes tratados (ver sin embargo los resultados de Braga y colaboradores reseñados arriba) que reduciría el proceso inflamatorio asociado a la patogénesis de las características lesiones cardiacas de la fase terminal de la enfermedad [11,12,16].

Otra seria limitación del tratamiento especifico de esta enfermedad basado en nitrofuranos y nitroimidazoles son los frecuentes efectos colaterales, probablemente asociados a su mecanismo de acción no específico (ver arriba), que incluyen anorexia, vómitos, polineuropatía periférica y dermopatías alérgica y pueden en con frecuencia llevar a la reducción de la dosis del tratamiento o su interrupción total [4,19].

Tomados en conjunto, estos hechos demuestran la urgente necesidad de desarrollar tratamiento específicos muchos mas eficaces y selectivos, particularmente para el tratamiento de la forma crónica de la enfermedad de Chagas [4-6,16,28]. En las secciones subsiguientes presentaremos avances recientes en esta dirección, basados en un proceso racional de desarrollo resultante de nuestro progreso en el conocimiento íntimo de aspectos bioquímicos y fisiológicos de agente etiológico.

Recientes avances en el desarrollo racional de nuevos tratamientos etiológicos específicos de la enfermedad de Chagas
1. Inhibidores de la biosíntesis de ergosterol
El T.cruzi, como la gran mayoría de los hongos y levaduras, requiere de esteroles endógenos específicos (ergosterol y análogos) para su supervivencia y reproducción tanto en el vector invertebrado como en sus hospederos vertebrados y no puede utilizar el colesterol presente en los tejidos donde prolifera o en los medios de cultivo; por esta razón este organismo es extraordinariamente susceptible a la acción de inhibidores de la biosíntesis de ergosterol (IBE) in vitro ( ver revisiones en [5,6,31,32]). Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que los IBE disponibles comercialmente y usados con mucho éxito en el tratamiento de micosis superficiales y sistémicas, como ketoconazol, itraconazol o terbinafina, no son capaces de erradicar el T.cruzi de pacientes o animales experimentales [33-36]. Estudios realizados en nuestro laboratorio en los últimos 10 años demostraron que una nueva familia de derivados triazólicos, que inhiben en forma muy potente y selectiva la síntesis de ergosterol a nivel de la enzima esterol C14 demetilasa, como el bistriazol D0870 (Zeneca Pharmaceuticals, Figure 1) y el SCH 56592 (posaconazol, Schering-Plough Research Institute, Figura 1), son capaces de inducir cura parasitológica radical tanto en infecciones agudas como crónicas causadas por el T.cruzi en animales experimentales; mas aun, los compuestos son activos por vía oral y tienen muy baja o nula toxicidad a mamíferos [5,6,31,37]. También se demostró que estos nuevos triazoles son activos in vivo contra cepas naturalmente resistentes a los nitrofuranos y nitroimidazoles y que tal actividad se mantiene aun cuando el hospedero vertebrado esta artificialmente inmunosuprimido [38,39]. Se ha concluido que la extraordinaria actividad in vivo de este tipo de compuestos esta asociada a la combinación de su elevada actividad intrínseca contra el parásito (concentraciones mínimas inhibitorias contra la forma amastigote intracelular del orden nanomolar o subnanomolar) y a propiedades farmacocinéticas especiales (grandes volúmenes de distribución y largos tiempos de vida media) [5,6,31]. Aunque el desarrollo del D0870 fue detenido en 1997, el posaconazol, que se encuentra en estudios clínicos Fase III a nivel mundial (incluyendo Latinoamérica) como antimicótico sistémico, es un candidato natural para estudios clínicos en pacientes con enfermedad de Chagas, tanto aguda como crónica. Este sería el primer tratamiento específico desarrollado en forma completamente racional para esta dolencia. Mas recientemente, usando los criterios arriba detallados para la identificación de nuevos IBE activos contra T.cruzi in vivo, hemos caracterizado otros compuestos triazólicos como el UR-9825 (Uriach y Compañia, Fig. 1), TAK-187 (Takeda Chemical Company, Fig.1) y ravuconazol (BMS 207,147, Bristol-Myers Squibb, Fig. 1) con actividad anti-T.cruzi in vivo comparable o superior a aquellas del D0870 o posaconazol [40-42]. En resumen, IBE con potente actividad intrínseca contra T.cruzi, grandes volúmenes de distribución y tiempos de vida media largos en vertebrados, son los primeros compuestos identificados capaces de inducir cura parasitológica radical en modelos animales de enfermedad de Chagas crónica y constituyen actualmente los mas avanzados candidatos para un nuevo tratamiento especifico de la enfermedad humana.


Figura 1: Estructura química de nuevos derivados triazólicos , inhibidores de la biosíntesis del ergosterol, que son capaces de inducir cura parasitológica en modelos murinos de enfermedad de Chagas, aguda y crónica.

2. Inhibidores de cisteína proteasas (cruzipaína)
La cruzipaína (también conocida como gp51/57 y cruzaína en su forma recombinante) es una proteasa dependiente de cisteína de la familia de la catepsina-L, la cual es responsable de la mayor parte de la actividad proteolítica presente en todos los estadio del ciclo de vida del T.cruzi [43-45]. Se han clonado, secuenciado y expresado heterologamente los genes que codifican por esta enzima en el parásito y se han establecido correlaciones detalladas entre la estructura y actividad de inhibidores de la misma [43]. Inhibidores específicos de la cruzipaína son capaces de inhibir selectivamente la proliferación tanto de epimastigotes extracelulares como de amastigotes intracelulares, así como inhibir la transformación epimastigote-tripomastigote metacíclico in vitro, lo que demuestra que la enzima cumple funciones esenciales en el ciclo de vida del parásito {*** CITATION EMPTY, OR MISSING CLOSURE ***000731). Tales resultados sugieren que la cruzipaína podría ser un blanco terapéutico casi ideal contra el T.cruzi y en efecto inhibidores de la enzima diseñados racionalmente han mostrado ser capaces de prolongar la sobrevida en inducir cura parasitológica en modelos murinos de enfermedad de Chagas, tanto aguda como crónica, con muy baja toxicidad [44,45].

Recientemente, usando métodos computacionales, se pudieron identificar dos nuevos motivos químicos con actividad potente y selectiva contra la cruzipaína, particularmente análogos peptídicos con grupos de urea y aril-tiourea los cuales demostraron tener actividad anti-T.cruzi in vitro e in vivo [46]. Sin embargo, hasta el momento la mayor limitación de este tipo de compuestos es su pobre actividad oral y sus cortos tiempos de vida media (eliminación) en vertebrado; se trabaja activamente en mejorar estas propiedades [45].

3. Inhibidores del metabolismo de tripanotión
Uno de los mas importantes resultados del estudio de la bioquímica comparativa del T.cruzi y vertebrados es el descubrimiento del tripanotión (N1,N8-bis(glutationil)-espermidina) y la tripanotión reductasa, que cumplen en organismos del orden Kinetoplastida funciones equivalentes a las del glutation y la glutation reductasa de mamíferos, en el mantenimiento del nivel de oxido-reducción celular [47,48]. Usando métodos de ingeniería genética se ha demostrado que esta enzima es esencial para la supervivencia del parásito tripanosomatídeo Leishmania donovani [49]. Por otro lado, se ha conseguido que la inactivación o reducción de la expresión del gen de la tripanotión reductasa en L.donovani y L.major reduce la habilidad de estos organismos para sobrevivir al estrés oxidativo en el interior de los macrófagos [50,51], pero la sobre-expresión del gen en L.donovani y T.cruzi no modifica substancialmente su susceptibilidad al estrés oxidativo inducido por agentes tales como nifurtimox, nitrofurazona y violeta de genciana [52]. Así pues, los inhibidores del metabolismo de tripanotión y en particular de la tripanotión reductasa y tripanotión sintetasa lucen como compuestos con gran potencial para el desarrollo de agentes anti-T.cruzi selectivos, usados solos o en combinación con otros compuestos capaces de inducir estrés oxidativo. Aunque durante mucho tiempo se investigo esta posibilidad sin obtener compuestos con actividad antiparasítica selectiva in vitro o in vivo [48,53], estudios mas recientes han hecho importantes avances en esta dirección [54-56]

4. Inhibidores de la toma y metabolismo de purinas
Los parásitos tripanosomatídeos tienen un requerimiento absoluto de purinas exógenas pues no son capaces de producir esos compuestos esenciales de novo [57]. La hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (HGFRT) es una enzima única de este grupo de organismos, involucrada en la incorporación de estos compuestos al metabolismo celular de los parásitos [57]. El alopurinol (4-hidroxi-pirazol-(3,4d)-pirimidina) es un compuesto que ha sido usado desde hace muchos años en el tratamiento de la gota en humanos, pues en vertebrados es convertido en oxipurinol, que es un potente inhibidor de la xantina oxidasa. Por el contrario, en tripanosomatídeos -que no contienen xantina oxidasa- este compuesto actúa mas bien como un análogo de purina y es incorporado, vía HGFRT, el ADN celular lo que conlleva a una dramática alteración de la síntesis de ARN y proteínas [57,58]. El alopurinol demostró inicialmente potente actividad anti-T.cruzi in vitro e in vivo, pero pronto se descubrió que existían grandes diferencias en la susceptibilidad in vivo a este compuesto por parte de diferentes cepas del T.cruzi [59,60]. Aunque han habido numerosos reportes, con resultados contradictorios, sobre la actividad del compuesto en infecciones causadas por T.cruzi en humanos, un estudio multicéntrico lanzado en 1992 in Argentina, Brasil y Bolivia bajos los auspicios y supervisión de la Organización Mundial de la Salud fue interrumpido al cabo de un año porque fue un patente fracaso terapéutico [2,61]. Las razones de la baja eficacia del alopurinol contra muchas cepas del T.cruzi no han sido completamente aclaradas, pero están probablemente relacionadas con la baja incorporación del compuesto por parte del parásito [59,60], así como probablemente a propiedades farmacocinéticas inapropiadas para esta aplicación. Aun así, la HGFRT sigue siendo un blanco terapéutico muy atractivo contra este parásito y recientemente se ha reactivado el trabajo en la búsqueda de mejores inhibidores de la enzima, con potencial actividad antiparasítica. Freymann et al. [62] han reportado recientemente que, partiendo de la estructura tridimensional de la HGFRT, obtenida por cristalografía de rayos-X, se pudieron identificar 22 compuestos capaces de asociarse a la conformación del estado de transición de la enzima, de los cuales 16 demostraron ser activos contra la enzima in vitro y de ellos 8 fueron capaces de bloquear la proliferación de la forma amastigote intracelular del T.cruzi. Tales resultados sugieren que en el futuro cercano inhibidores de la HGFRT desarrollados racionalmente podrían ser valiosos compuestos para el desarrollo de drogas anti-T.cruzi altamente selectivas.

5. Inhibidores de la síntesis de fosfolípidos y señalización celular
Análogos metabolicamente inertes de lisofosfolípidos (ALP) han sido investigados en las ultimas dos décadas como agentes anti-tumorales y anti-leucemicos [63,64]. Este tipo de compuestos son también activos contra T.cruzi y varias especies del genero Leishmania, tanto in vitro como in vivo [65-68]. La miltefosina (hexadecil-fosfocolina) se encuentra en estudios clínicos avanzados (Fase III/IV) como el primer tratamiento oral para la leishmaniasis visceral y ha sido aprobada para ese uso por las autoridades sanitarias de la India [69-71]. Aunque el mecanismo de acción de este tipo de compuestos contra células normales y tumorales de mamíferos ha sido ampliamente investigado [63,64], las bases moleculares de su acción antiparasítica no eran bien entendidas. Trabajos recientes de nuestro laboratorio investigaron el mecanismo de acción de tres de estos compuestos, miltefosina, edelfosina (ET-18-OCH3) e ilmofosina contra el T.cruzi [72]. Los resultados indicaron que un mecanismo primario de acción de los ALP contra este parásito es un bloqueo selectivo de la síntesis del fosfolípido principal de sus membranas, fosfatidil-colina, la cual procede en protozoarios y hongos a través de la ruta de transmetilación de Greenberg, en contaste con la situación en células de mamíferos, donde la ruta de la CDP-coline (Kennedy) es la predominante [72]. Los ALP son promisorios agentes antiparasíticos, de muy baja toxicidad para el hospedero vertebrado.

6. Inhibidores del metabolismo de polifosfatos
En el curso de la última década se ha caracterizado en protozoarios patógenos de los ordenes Kinetoplastida y Apicomplexa un nuevo tipo de organela, conocida como acidocalcisoma, que es el mas importante reservorio de calcio en estos organismos [73,74]. Mas recientemente se demostró, usando resonancia magnética nuclear de 31P in vitro e in vivo, que los contra-iones mas importantes del calcio y el magnesio en los acidocalcisomas son polifosfatos de cadena corta (principalmente pirofosfato, tri y tetra-polifosfato), cuya concentración total en estas células es >10 veces superior a la del ATP [75,76]. También se ha demostrado que existen enzimas especificas involucradas en transducción de energía dependientes de pirofosfato, como las bombas de protones presentes en los acidocalcisomas y la membrana plasmática del parásito [73,77-79] y que los polifosfatos son rápidamente movilizados e hidrolizados en células sometidas a estrés osmótico y nutricional, lo que demuestra su importancia en el mantenimiento de los niveles energéticos y de la homeostásis iónica de estas células [80]. Los bisfosfonatos son análogos no metabolizables del pirofosfato que pueden interferir en su metabolismo; actualmente un grupo de estos compuestos (bisfosfonatos N-alquilados) son frecuentemente usados en el tratamiento de trastornos de la resorción ósea en humanos como la osteoporosis, enfermedad de Paget e hipercalcemia asociada a linfomas [81]. Trabajos recientes en varios laboratorios ha demostrado que estos compuestos, inhibidores específicos de enzimas de la ruta biosintética de isoprenoides y esteroles [81-87], son potentes agentes anti-T.cruzi y anti-Leishmania, tanto in vitro como in vivo [75,88-90]. Estos resultados sugieren que los bisfosfonatos pueden convertirse a corto plazo en una familia completamente nueva de agentes antiparasíticos, potentes, selectivos y de amplio espectro [74,79,91]. También se investiga la posibilidad de bloquear selectivamente la actividad de las bombas iónicas dependientes de pirofosfato presentes en los parásitos, que no tienen contraparte en sus hospederos vertebrados [92].

7. Inhibidores del metabolismo del inositol
El inositol es un compuesto esencial para la supervivencia y proliferación de muchos organismos, entre ellos el T.cruzi [93], siendo su función principal participar en la biosíntesis de lípidos complejos, involucrados en señalización como el fosfatidil-inositol (PI). En T.cruzi derivados glicosilados del PI se ubican en la monocapa externa de la membrana plasmática, formado parte del glicocalix y/o "anclas" de glicofosfatidil-inositol para ciertas proteínas [93]; por otro lado, en la monocapa interna de la membrana se ubican derivados fosforilados del PI que participan, como en otras células eucarióticas, en procesos de señalización. Oliveira and Einicker-Lamas [94] han investigado el posible uso de derivados fluorinados del inositol como agentes anti-T.cruzi y reportan acciones diferenciales de los mismos contra el parásito y las células hospederas. De particular interés es el 6-deoxi-6-fluoro-inositol que, aunque es permeable a todo tipo de células, incluyendo la de vertebrados, es completamente inocuo para estas pero tiene potente acción antiproliferativa contra las formas extracelulares (epimastigotes) e intracelulares (amastigotes) del T.cruzi. Este tipo de compuestos pueden ser de utilidad en el desarrollo de nuevos agentes antiparasíticos selectivos.

Conclusiones
Del análisis previamente desarrollado podemos arribar a las siguientes conclusiones:

Agradecimientos
Las investigaciones desarrolladas en el laboratorio del autor han recibido el financiamiento de la Organización Mundial de la Salud, la Fundación Guggenheim, el Instituto Medico Howard Hughes, el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT) de Venezuela, la Universidad Central de Venezuela (UCV) y el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

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