Familia de proteínas Bcl-2: árbitros de supervivencia celular

La proteína Bcl-2 y las proteínas citoplasmáticas relacionadas a él son reguladores claves de la apoptosis, el programa suicida celular crítico para el desarrollo, la homeostasis celular y la protección contra patógenos. Las moléculas más similares a Bcl-2 promueven la supervivencia celular por inhibición de adaptadores necesarios para la activación de las proteasas (caspasas), las cuales son responsables de desmantelar la célula. En contraste, aquellas moléculas relativamente más distanciadas a Bcl-2 promoverán la apoptosis, aparentemente a través de mecanismos que incluyen desplazamiento de adaptadores a partir de proteínas de pro-supervivencia. Por lo tanto, por medio de algunas señales apoptóticas, el balance entre estas acividades competitivas determina la forma celular.

Los miembros de la familia Bcl-2 son esenciales para mantener los mayores sistemas de órganos y las mutaciones que los afectan están implicados en el cáncer.

La vida requiere muerte. Los organismos multicelulares eliminan células redundantes, dañadas o infectadas mediante un programa estereotípico de suicidio celular llamado apoptosis. El interés en el control de la apoptosis ha crecido exponencialmente con el reconocimiento de su rol vital en el desarrollo normal, en la homeostasis tisular y la defensa contra patógenos y con la comprensión de que el disturbio de la apoptosis puede contribuir al cáncer y a las enfermedades autoinmunes y degenerativas.

El análisis genético del nematode Caenorhabditis elegans reveló que dos locus, ced-3 y ced-4, eran esenciales para la muerte celular programada durante el desarrollo del gusano y que un tercero el ced-9 podría prevenir la acción de aquellos. El primer regulador de la apoptosis en mamíferos se detectó al descubrir que bcl-2, el gen activado por translocación cromosómica en el linfoma folicular humano, permitía la supervivencia de células hematopoyéticas dependiente de citokina, en un estado quiescente, en la ausencia de citokina. Este descubrimiento, verificado en otras líneas celulares y ratones transgénicos, estableció que la supervivencia y proliferación celular estaban bajo control genético separado y que el disturbio en ambas probablemente contribuiría a la neoplasia.

El mecanismo de apoptosis está marcadamente conservado entre especies, aunque con la mayor complejidad esperada para mamíferos. Tanto funcional como estructuralmente se probó que los productos CED-9 y el Bcl-2 son homólogos y que su función de supervivencia es opuesta tanto al primo relativamente cercano Bax como al distante Bik (también conocido como Nbk) de mamífero y al EGL-1 de nematodes. La etapa de ejecución se clarificó al probar que CED-3 pertenecía a una nueva familia de proteasas, ahora llamadas caspasas, cuyo clivaje y activación secuencial de proteínas target claves, desmantelaba la célula. Se conoce además que la síntesis de caspasas como activadores minímamente activos (gracias al péptido señal) previene su activación prematura y que tanto el misteriosamente largo CED-4 como su homólogo en mamíferos el Apaf-1 serían adaptadores que facilitan la autocatálisis que inicia la cascada proteolítica.

La creciente familia Bcl-2 podría registrar de alguna manera diversas formas de daño intracelular, indicando si otras células han provisto un estímulo positivo o negativo e integrar estas señales que compiten para determinar si la célula "es o no es". Sin embargo, ciertas señales de muerte celular, tales como aquellas desde el "receptor de muerte" CD95 (también conocido como Fas o APO-1), grandemente bypasearían el paso controlado por Bcl-2 (Fig. 1).
 
 
 
 

Actividades antagónicas de la familia Bcl-2

Se han identificado al menos 15 miembros de la familia Bcl-2 en células de mamíferos y varios otros en virus. Todos los miembros poseen al menos una de cuatro porciones conservadas, conocidas como dominios de homología Bcl-2 (BH1 a BH4) (Fig. 2) y funciones antagónicas. Dentro de la amplia familia Bcl-2 pueden indicarse tres subfamilias: la cohorte Bcl-2 que promueve la supervivencia celular, mientras que las cohortes Bax y BH3 facilitan la apoptosis.

La mayoría de los miembros de pro-supervivencia, los cuales pueden inhibir la apoptosis frente a una amplia variedad de injurias citotóxicas, contienen al menos BH1 y BH2 y aquellos más similares a Bcl-2 tienen los cuatro dominios. Las dos subfamilias pro-apoptóticas difieren marcadamente en su parentezco a Bcl-2. Bax, Bak y Bok (también llamado Mtd) que pertenecen a la subfamilia Bax, contienen BH1, BH2 y BH3 y se asemejan estrechamente a Bcl-2. En contraste, a excepción del dominio corto BH3 (de 9 a 16 residuos) la subfamilia BH3 no está relacionada a Bcl-2 y sólo Bik y Blk son similares entre sí. Estas proteínas de "dominio BH3" podrían representar los antagonistas fisiológicos de las proteínas de pro-supervivencia, debido a que la muerte celular programada en C. elegans requiere EGL-1 (Fig. 1), la cual se une a CED-9 y actúa a través de él. BH3 es esencial para la función de los "killers", incluyendo EGL-1.

Los miembros de las familias pro- y anti-apoptóticas pueden heterodimerizarse y aparentemente titularían la función de otros miembros, sugiriendo que su concentración relativa podría actuar como reostato para el programa de suicidio. Estudios de mutagénesis permitieron establecer que los dominios BH1, BH2 y BH3 fuertemente influencian homo- y hetero-dimerización y la estructura tridimensional de Bcl-xL proveyó la explicación (Fig. 3). El acercamiento de las a hélices en sus regiones BH1, BH2 y BH3 crea una grieta hidrofóbica alargada a la cual se puede unir una a hélice anfipática de miembros de la subfamilia BH3. El acoplamiento BH3-grieta recuerda una unión ligando-receptor; esto daría cuenta de la dimerización dentro de la familia. En consecuencia, Bax y sus análogos tendrían conformaciones alternantes: una semejante a Bcl-xL y otra con el dominio BH3 rotado hacia fuera para permitir su inserción en la grieta de una proteína de pro-supervivencia.

La heterodimerización no es necesaria para la función de pro-supervivencia como se pensaba antes sino que es esencial para la actividad pro-apoptótica del grupo BH3, pero menos para el grupo Bax, el cual puede tener un impacto citotóxico independiente. Es controvertida la idea de si verdaderamente Bax se une a Bcl-2 en el interior de la célula, ya que los detergentes usados en la lisis celular facilitan su asociación.

Algunos agonistas de muerte celular permiten preferencialmente target subgrupos de represores de muerte. Bok, por ejemplo, interactúa con Mcl-1 y la proteína viral BHRF1 de Epstein Barr pero no con Bcl-2, Bcl-xL or Bcl-w. Dentro del grupo BH3, Bid es promiscuo, uniéndose a Bax y Bak así como también a las proteínas anti-apoptóticas, pero los otros miembros se unen sólo a ciertos inhibidores de muerte.

Bcl-2 se ubica en la cara citoplasmática de la membrana mitocondrial externa, del retículo endoplásmico (ER) y en la envoltura nuclear y puede registrar daños a estos compartimientos y afectar su comportamiento, tal vez modificando el flujo de pequeñas moléculas o proteínas. Aunque el dominio hidrofóbico carboxi terminal de Bcl-2 (Fig. 2) es importante en el anclaje a membrana, su deleción no elimina la función de supervivencia de Bcl-2. Además, sólo una pequeña fracción de Bcl-xL reside en la membrana y Bax es citosólico ante un estímulo apoptótico, aún cuando ambos, semejante a la mayoría de otros miembros de la familia portan dominios hidrofóbicos (Fig. 2). Se cree que Bcl-2 y las proteínas relacionadas a él anclan sobre proteínas específicas en cada organela. Los sitios potenciales de anclaje en el ER incluyen las proteínas integrales de membrana Bap31 y BI-1.

Mecanismos potenciales

Las evidencias bioquímicas y genéticas de C. elegans sugieren que las proteínas de pro-supervivencia pueden funcionar directamente inhibiendo la capacidad de moléculas semejantes a CED-4 para la activación de caspasas (Fig. 4). CED-9 y Bcl-xL pueden unirse a CED-4, la cual a su vez se une CED-3 y estimula su activación. La región BH4 de Bcl-xL se requiere para la actividad de pro-supervivencia y la interacción con CED-4 y podría servir como un sitio de unión directa para CED-4 o para modular la estructura de Bcl-xL completa. Se ha reportado que Bcl-xL se une también a la porción like-CED-4 de Apaf-1 mientras procaspasa-9 se une a su dominio amino terminal de unión de caspasa (CARD) (Fig. 4). Bcl-xL puede inhibir la asociación de Apaf-1 con procaspasa-9 y por lo tanto prevenir la activación de caspasa-9. Miembros pro-apoptóticos relacionados como Bik pueden liberar CED-4/Apaf-1 a partir del inhibidor de muerte Bcl-xL (Fig. 4).

Aparentemente, las proteínas de pro-supervivencia mantendrían también la integridad de las organelas. Bcl-2 directa o indirectamente previene la liberación desde las mitocondrias del citocromo C, el cual junto con adenosina trifosfato (ATP) podría facilitar un cambio en la estructura de Apaf-1 para permitir el reclutamiento y procesamiento de la procaspasa-9 (Fig.4). Aún queda por esclarecer si el daño de la organela es el disparador de la apoptosis o un paso de amplificación.

La estructura de Bcl-xL (particularmente sus a 5 y a 6-hélices) (Fig. 2) que se asemeja a los dominios de inserción de membrana de toxinas bacterianas, sugiere la hipótesis de que los miembros que portan los dominios BH1 y BH2 funcionan formando poros en organelas tales como mitocondrias. Bcl-xL, Bcl-2 y Bax forman canales en la bicapa lipídica in vitro y aquellos creados por Bax y Bcl-2 tienen características distintas, incluyendo alguna selectividad iónica. A la fecha pocos datos vinculan esta capacidad al control de apoptosis.

Muerte independiente de caspasas

Mientras la mayoría de las proteínas pro-apoptóticas probablemente antagonizan directamente con las proteínas de pro-supervivencia vía sus "ligandos de muerte" BH3 (fig. 4), el grupo Bax también mata dañando las organelas. Aunque Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe aparentemente carecen de proteínas like-Bcl-2, de CED-4 y caspasas, ambas son muertas por Bax y Bak y Bcl-2 puede protegerlas, aparentemente previniendo la disrrupción mitocondrial. La deleción de BH3 elimina la toxicidad, implicando homodimerización. Aún frente a la presencia de un inhibidor de caspasa, la sobre-expresión de proteínas like-Bax o su dimerización mata las células de mamíferos, provocando la condensación de DNA y la alteraciones de membrana sin activación de caspasas o degradación de DNA. Las proteínas like-Bax y la Bax permitirían mediar muerte independiente de caspasa vía la actividad de formación de canal, el cual podría promover la transición de la permeabilidad mitocondrial o agujerear la membrana mitocondrial externa.

Regulación de miembros de la familia

La familia de Bcl-2 es regulada por citokinas y otras señales de supervivencia-muerte de diferentes niveles.Varios genes de pro-supervivencia son inducidos transcripcionalmente por ciertas citokinas y el bax es inducido en algunas células como parte de la respuesta de daño mediado por p53. Sin embargo, la supervivencia celular mediada por citokina también involucra regulación postranslacional. En células hematopoyéticas estimuladas por interleukina-3 (IL-3), Bad es fosforilado y el producto resultante es secuestrado en el citosol por las proteínas 14-3-3, previniendo la inhibición de Bcl-xL. La señal desde el receptor parece que es traducida mediante fosfoinositide kinasa-3 a través de la kinasa Akt para Bad. Para los miembros de pro-supervivencia, la fosforilación puede tanto aumentar como suprimir la actividad. Se piensa que sitios de unión conocidos en el loop flexible no conservado (Fig.2) regulan negativamente la actividad de Bcl-xL. Bcl-2 puede ser activado por la fosforilación de Ser70 pero inactivada o alterada por fosforilación de varios sitios del loop, tal vez por Jun kinasa (JNK). La activación sostenida de JNK o de las vías de la kinasa p38, tal vez después de la activación de las caspasas, ha sido implicada en la apoptosis y los miembros de la familia de Bcl-2 serían targets de interés.

Roles fisiológicos

Bcl-2 protege contra diversos insultos citotóxicos, por ej., la radiación g y UV, la supresión de citokinas, dexametasona, estauroesporina y drogas citotóxicas. Sin embargo, la selección de células T autorreactivas en el timo no es bloqueada por el transgen Bcl-2. Más aún, Bcl-2 protege pobremente contra la apoptosis de linfocitos inducida por unión del receptor CD95. Así, en al menos el sistema linfoide, la vía mayor inducida por CD95, el cual activa la caspasa 8, bypasea el paso común inhibible de Bcl-2 para la mayor parte de las vías de estrés (Fig. 1). CD95 también podría disparar vías alternativas, ya que el Bcl-2 protege contra la muerte inducida por CD95 en ciertos tipos celulares.

Aunque los genes de pro-supervivencia parece que tienen funciones efectoras equivalentes, experimentos realizados con ratones knockout han detectado que cada uno de ellos mantiene sistemas de órganos particulares. A pesar de la extendida expresión de Bcl-2 durante la embriogénesis, los ratones bcl-2-/- se desarrollan normalmente y sólo más tarde exhiben marcada apoptosis linfoide, lesiones de melanocitos, neuronas e intestinales y enfermedad terminal de riñón. En contraste, los ratones bcl-x-/- mueren en útero como consecuencia de muerte masiva de células eritroides y neuronales y los experimentos quimera sugieren que el desarrollo de células B pero no T está debilitado. Los ratones adultos bcl-w-/- son saludables pero la espermatogénesis está abatida por la muerte de células germinales y de células de Sertoli soporte.

Como es esperable por la pérdida de un gen pro-apoptótico, los ratones bax--/- exhiben aumento en algunos tipos celulares: células de la granulosa, ciertas neuronas, linfocitos y células germinales maduras. Sus timocitos exhiben sensibilidad normal a la irradiación g , por lo tanto, Bax no es esencial para la apoptosis dependiente de p53. La cruza de ratones knockout reveló que Bax es responsable por mucha de la muerte neuronal en ratones bcl-x-/- y linfoide en ratones bcl-2-/-.

Impacto en el ciclo celular

La familia de Bcl-2 puede modular la progresión del ciclo celular. Bajo condiciones de crecimiento subóptimas, Bcl-2 promueve la salida a quiescencia y retarda la reentrada en el ciclo. Este efecto es genéticamente separable de su función de supervivencia, debido a que la inhibición del ciclo celular pero no la función de pro-supervivencia es eliminada por una deleción en el loop no conservado o mutación de tirosina-28. La inhibición podría involucrar una proteína que puede unirse a esta región de Bcl-2, tal como la calcineurina fosfatasa. Las células T que expresan Bcl-2 hacen menos IL-2, la citokina requerida para su progresión dentro de la fase S, aparentemente a causa de translocación nuclear reducida del factor de transcripción NFAT. El tránsito de NFAT requiere calcineurina comigrante, cuyo Bcl-2 puede secuestrar en la membrana citoplasmática. El mecanismo del efecto inhibitorio del ciclo celular puede haber evolucionado para reducir el impacto oncogénico de Bcl-2.

Implicancia en cáncer

La apoptosis normalmente elimina las células con DNA dañado o con un ciclo celular aberrante, esto es, la mayor parte de aquellas que probablemente engendren un clon neoplásico. Con el descubrimiento de la función antiapoptótica del oncogen bcl-2, surgió el concepto que un umbral aumentado para la apoptosis representa un paso central para la tumorogénesis. El ímpetu oncogénico de la translocación de bcl-2 encontrado en la mayoría de los linfomas foliculares y algunos casos de linfoma celular difuso y leucemia linfocítica crónica, fue verificado en ratones transgénicos para bcl-2. Estos ratones acumularon exceso de linfocitos B maduros no cíclicos y linfomas que frecuentemente portan translocaciones myc, las cuales acompañan también la progresión del linfoma folicular. El sinergismo entre myc y bcl-2 en tumorogénesis se demostró primero in vitro, luego en linfoma y cáncer de mama en ratones bi-transgénicos. Su cooperatividad puede reflejar en parte la capacidad de cada gen para oponerse a un impulso anti-oncogénicos frente a otro. Bajo condiciones de crecimiento limitantes in vivo, la sobre-expresión del Myc lleva tanto a una proliferación como a la apoptosis, mientras que el Bcl-2 fomenta la salida del ciclo celular tanto como la de supervivencia. Los cambios del código de Bcl-2 pueden también liberar la inhibición del ciclo celular: muchos linfomas foliculares progresan desplegando mutaciones "missense" en la región amino terminal.

Todos los genes like-bcl-2 de pro-supervivencia son potencialmente oncogénicos y algunas mutaciones probablemente aumentan su expresión indirectamente. En las células hematopoyéticas, las oncoproteínas tales como Mys, Ras y AML1-ETO inducen expresión de bcl-2 y ésta de bcl-2 y A1 es frecuentemente elevada en la leucemia mieloide y el cáncer de estómago respectivamente. Para tumores sólidos la presente correlación variable entre la expresión de tales genes y el pronóstico puede tornarse más claro a medida que son analizados más miembros de la familia.

Los miembros de la familia de pro-apoptóticos pueden actuar como supresores de tumores. El Bax está mutado en el cáncer gastrointestinal humano y en algunas leucemias. Más aún, su expresión es activada en algunos tipos celulares mediante el supresor de tumor p53, el cual puede provocar apoptosis. En un modelo transgénico de tumores cerebrales de plexo coroideo, así como también en fibroblastos, la pérdida de bax redujo la apoptosis y aumenta la tumorogenicidad pero sólo a la mitad como lo hace la pérdida de p53. Así, bax no es el único gen responsable para la apoptosis conducida por p53.

Incertidumbres y perspectivas

Está presente el complejo Bcl-xL-Apaf-1 en células saludables o se forma sólo después de la señal de muerte? Cómo restringe esta asociación la actividad de Apaf-1?. Son las pro-caspasas parte de complejos ternarios o se asocian sólo con Apaf-1 liberado? Si se probara que los homólogos de CED-4 son múltiples, cada uno tendría un regulador de pro-supervivencia específico y activaría una procaspasa específica? Sería interesante conocer cómo los miembros de la familia son disparados para organelas particulares, cómo ellos afectan funciones de las organelas, la relevancia fisiológica de la muerte independiente de caspasa y la capacidad de formación del poro.

Los estudios estructurales sobre las proteínas like-Bax podría aclararnos por qué muestran muchos rasgos con el grupo de pro-supervivencia aún teniendo función opuesta. Para la familia BH3 recientemente descripta, los datos cuantitativos junto con las proteínas de pro-supervivencia podrían clarificar si cada una tiene un "partner" preferido o si es más promiscuo. Sus secuencias muy divergentes pueden sugerir que cada uno responde a una señal diferente, una para el citoesqueleto desordenado y otra para el DNA dañado. Aún falta estudiar si las señales de muerte-supervivencia alteran su expresión o provocan modificación post-translacional.

Al clarificar como la familia de Bcl-2 gobierna la apoptosis podríamos ajustar los alcances de la apoptosis en la clínica. La pequeña interface entre miembros opuestos (Fig. 3) provee un target para intervención farmacológica, ilustrada por la acción apoptótica de los péptidos BH3 del residuo 16, mientras que el complejo Bcl-xL-Apaf-1 y los sitios de perforación de la organela podrían ofrecer otros.

Las enfermedades degenerativas y los episodios de isquemia aguda claramente se beneficiarían a partir de agentes farmacológicos que retarden la apoptosis. Para el cáncer, detectando los defectos apoptóticos en tipos específicos de tumores podrían engendrarse terapias que restablecieran el programa normal de muerte. Paradógicamente, los cambios oncogénicos hacen a ciertos tumores más susceptibles a la apoptosis y esto haría más factible explotar esta vulnerabilidad.