Receptores de la Muerte: señalización y modulación


La apoptosis es un mecanismo que permite a los metazoos controlar el número de células en tejidos y eliminar células individuales que comprometen la supervivencia del animal. Ciertas células sobre la superficie de la membrana plasmática, poseen un tipo particular de receptores denominados receptores de la muerte. Estos receptores detectan la presencia de señales extracelulares de muerte y en respuesta, inician inmediatamente la puesta en marcha de la maquinaria apoptótica intrínseca.

La apoptosis juega un rol clave tanto en el desarrollo como en la homeostasis de metazoos. Las células que mueren por apoptosis durante el desarrollo embrionario en el proceso de morfogénesis o sinaptogénesis y en el animal adulto, durante el recambio tisular o al finalizar la respuesta inmune. Pese a que el rol fisiológico de la apoptosis es crucial, la aberración de este proceso puede ser perjudicial para el organismo. Así, la apoptosis no programada de ciertas neuronas puede contribuir al desarrollo de desórdenes tales como las enfermedades de Parkinson o la de Alzheimer, mientras que las fallas en iniciar la apoptosis de las células en división con daños de su DNA contribuye al desarrollo del cáncer.

La maquinaria apoptótica básica

Todas las células de los metazoos poseen un aparato enzimático similar que inicia el proceso de apoptosis bajo activación. El nematode Caenorhabditis elegans ha sido un excelente modelo para estudiar los componentes de la maquinaria de muerte celular. Tres productos génicos de Caenorhabditis elegans son importantes para la apoptosis: CED-3 y CED-4 actúan como promotores, mientras que CED-9 la inhibe. CDE-3 es una caspasa, una cisteína - proteasa que cliva ciertas proteínas a continuación de sitios específicos de residuos de ácido aspártico; actúan como zimógenos (precursores enzimáticamente inactivos de las enzimas proteolíticas), que son activados a través del autoclivaje. CED-4 se une a CED-3 y promueve la activación de éste, mientras que CED-9 forma complejos con CED-4 o CED-3, manteniendo a CED-3 inactiva. El estímulo apoptótico, causa la disociación de CED-9 permitiendo la activación de CED-3, llevando a la célula a la muerte celular por apoptosis. En los vertebrados han evolucionado familias completas de genes que recuerdan a los genes de la muerte de C. elegans. Las caspasas de mamíferos son similares a CED-3. Apaf-1 es la única homóloga de CED-4. Los productos génicos de la familia de Bcl-2 de mamíferos están relacionados con CED-9 pero incluyen dos subgrupos de proteínas que actúan tanto como inhibidoras como promotoras de apoptosis.

Los receptores de la muerte poseen acceso directo a la maquinaria apoptótica

Las señales de supervivencia del ambiente celular, y sensores internos de integridad celular mantienen normalmente la maquinaria apoptótica en continuo chequeo. En la eventualidad que la célula pierda los contactos con las células que la rodean o exhiban un daño interno irreparable, la célula inicia la apoptosis. Una célula que recibe señales conflictivas conduciendo hacia o atenuando su ciclo celular, también dispara apoptosis. Los mamíferos han evolucionado a otros mecanismos que permiten al organismo dirigir a células individuales a la autodestrucción. Este tipo de apoptosis "instructiva" es especialmente importante en el sistema inmunológico. Los receptores de la muerte, receptores de la superficie celular que transmiten señales de apoptosis ¾ iniciadas por "ligandos de la muerte" específicos¾ juegan un rol central en la apoptosis instructiva. Estos receptores pueden activar caspasas por uniones de ligandos en pocos segundos, llevando a la muerte celular por apoptosis en unas pocas horas.

Los receptores de la muerte pertenecen a la familia génica de los receptores del Factor de Necrosis Tumoral (TNF), que son definidos por dominios extracelulares ricos en cisteína. Los receptores de la muerte poseen en adición una secuencia citoplasmática denominada el "dominio de la muerte". Los dominios de la muerte a menudo permiten conducir la maquinaria apoptótica, pero en algunos casos, ellos cumplen funciones diferentes y aún contrapuestas a las de la apoptosis. Algunas moléculas que transmiten señales desde los receptores de la muerte contienen ellos mismos dominios de la muerte.

Los receptores de la muerte mejor caracterizados son los CD95 (también llamados Fas o Apo-1) y los TNFR1 (también denominados p55 o DC120a). Receptores adicionales son el CAR1 de aves; el receptor de la muerte 3 (CD3, también llamado Apo-3, WSL-1, TRAMP o LARD), DR4 y DR5 (también llamado Apo-2, TRAIL-R2, TRICK 2 o KILLER)

El receptor del factor de crecimiento nervioso (NGF) p75 también contiene un dominio de la muerte. Los ligandos que activan estos receptores, con la excepción de NGF, están estructuralmente relacionados con moléculas que pertenecen a la superfamilia del TNF. El ligando del CD95 (CD95L) se une al CD95; el TNF y la linfotoxina a se unen a TNFR1, el ligando de Apo-3 (Apo-3L también llamado TWEAK) une al DR3 y el ligando de Apo-2 (Apo-2 L también llamado TRAIL) une al DR-4 y DR-5. El ligando del CAR1 es desconocido.
 

Diferentes nombres de los receptores de muerte
Ligandos
CD95
Apo-1
Fas
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CD95L
TNFR1
p55
DC120a
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TNF / linfotoxina a
CAR-1 (aves)
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Desconocido
CD3
Apo-3
WSL-1
TRAMP
LARD
Apo-3L o TWEAK
DR4 y DR5
Apo-2
TRAIL-R2
TRICK 2
KILLER
Apo-2L o TRAIL

Señalización para CD95

CD95 y CD95L juegan un rol importante principalmente en tres tipos de apoptosis fisiológica: (i) supresión periférica de células T maduras al final de una respuesta inmune; (ii) muerte de blancos como: células infectadas por virus y células cancerosas por mediada por células T citotóxicas y por células natural killer y (iii) muerte de células inflamatorias en sitios inmunoprivilegiados tales como el ojo. Las evidencias del rol del CD95 provienen de ciertas cepas de ratones y pacientes humanos que poseen deficiencias en los genes para CD95 o para CD95L. Tales mutaciones pueden conducir a la acumulación de células linfoides periféricas y a un síndrome caracterizado por agrandamiento masivo de los nodos linfoideos. CD95 y CD95L están también implicados en la supresión patológica de vigilancia de la supervivencia inmune, es decir, eliminación de las células inmunes reactivas a tumores que expresan constitutivamente CD95L.

En forma similar a los otros miembros de la familia de los TNFs, el CD95L es una molécula homotrimérica. La estructura cristalina de la linfotoxina a en complejo con TNFR1 sugiere por analogía que cada trímero de CD95L une tres moléculas de CD95. Debido a que los dominios de la muerte tienen una propensión a asociarse unos con otros, el ligamiento lleva a la agrupación de los dominios de los receptores de la muerte (Fig. 1); esto está soportado por el análisis de estructura por resonancia magnética nuclear y estudios de mutagénesis. Una proteína adaptadora llamada FADD (Fas-associated deathdomain también llamada Mort 1) luego también une a través de su propio dominio de muerte al agrupamiento de los receptores de la muerte. Los FADD también contienen un "dominio efector de muerte" que une a un dominio análogo repetido en tandem dentro de la forma zimogénica de caspasa-8 (también llamada FLICE o MACH). El dominio efector de muerte es un ejemplo específico de un dominio de interacción homofílica más global denominado CARD (dominio de reclutamiento de caspasas), el cual se encuentra en varias caspasas con grandes pro-dominios, incluyendo las caspasas -2, -8, -9 y -10. Bajo el reclutamiento mediado por FADD, la oligomerización de la caspasa-8 conduce su activación a través del autoclivaje. La caspasa-8 luego activa caspasas efectoras tales como la caspasa-9 ¾ el homólogo funcional de CED-3¾ llevando la célula a apoptosis. Los estudios con ratones knock-out para FADD y con ratones transgénicos que expresan un mutante dominante negativo de FADD (FADD-DN) en células T establecieron que FADD es esencial en la inducción de apoptosis por CD95. Sorpresivamente, estos ratones exhiben una reducción en la proliferación de las células T en respuesta a la estimulación antigénica; mas aún, la supresión FADD causa letalidad embrionaria. Estos resultados son consistentes con que FADD tenga otras funciones de señalamiento críticas además del acoplamiento de CD95 a caspasa-8.

Una familia de proteínas virales llamadas vFLIPs y la proteína celular relacionada llamada cFLIP (también llamada casper, I-FLICE, FLAME o CASH) contiene un dominio efector de muerte similar al segmento correspondiente de FADD y de caspasa-8. El rol de FLIP es controvertido, ya que su sobrexpresión tanto inhibe como activa los procesos apoptóticos. Además de FADD otras proteínas citoplasmáticas pueden unirse a CD95, incluyendo Daxx, que reconoce el dominio de muerte de CD95. El Daxx puede activar un patrón de muerte independiente de FADD que involucra la quinasa amino terminal de c-Jun (JNK). Como varias células deficientes en FADD muestran resistencia completa a la apoptosis inducida por CD95 parece que al menos en algunos tipos de células, Daxx no está acoplada a la apoptosis de CD95.

Señalamiento por TNFR1

El TNF es producido principalmente por macrófagos activados y células T en respuesta a las infecciones. Por medio de TNFR1, el TNF activa los factores de transcripción NFk B y AP-1, llevando a la inducción de genes proinflamatorios e inmunoinflamatorios. En algunos tipos celulares, el TNF también induce apoptosis a través de TNFR1. A diferencia de CD95, el TNFR1 raramente dispara apoptosis a menos que la síntesis de proteínas sea bloqueada, sugiriendo la preexistencia de factores celulares que suprimen los estímulos apoptóticos generados por TNF. La expresión de estas proteínas supresoras probablemente es controlada a través de NFk B y JNK/AP-1, como la inhibición de los patrones que sensibilizan la apoptosis inducida por TNF.

El TNF trimeriza sobre TNFR1, induciendo la asociación de los dominios de los receptores de la muerte (Fig. 2). Subsecuentemente un adaptador denominado TRADD (TNFR-associated death domain) une a través de su propio dominio de la muerte a los receptores de la muerte agrupados. Los TRADD funcionan como una plataforma de adaptación que recluta varias moléculas de señalamiento al receptor activado: TNFR-associated factor-2 (TRAF-2) y la proteína de interacción con el receptor (RIP) estimulando el patrón de activación del NFk B y el JNK/AP-1, mientras que FADD actúa mediando la acción proapoptótica. De estos solo RIP tiene actividad enzimática, especialmente como serina-treonina quinasa; sin embargo, no se ha establecido aún un rol para la actividad de quinasa del RIP.

TRAF-2 y RIP activan la NFk B-inducing kinase (NIK), que a la vez activa el complejo quinasa inhibidor de NFk B (Ik B): IKK. Este último fosforila a Ik B, llevándolo a la degradación, permitiendo así, que el NFk B se movilice hacia el núcleo para activar la transcripción. El patrón desde TRAF-2 y RIP a JNK involucra una cascada que incluye la proteína quinasa activadora mitogénica (MAP): MEKK1, la JNKK (JKN-kinase) y JKN. La MEKK1 está relacionada a NIK y está implicada en el patrón debido a que la quinasa-inactiva MEKK1 mutante bloquea la activación de JNK por TNF, sin embargo MEKK1 no une a TRAF-2 sugiriendo que otra quinasa que une TRAF2 actúa upstream en lugar de MEKK1.

Las células de ratones knock-out para el gene de TRAF-2, que expresan el mutante dominante negativo de TRAF2 poseen un ligero defecto en su respuesta a TNF por el NFk B. Así, TRAF2 podría no ser esencial para la activación por TNF de NFk B; alternativamente, podría existir otro miembro de la familia de los TRAF que una a TRADD y NIK, substituyendo a TRAF2. Células de ratones deficientes en TRAF2 carecen totalmente de activación de JNK en respuesta a TNF, demostrando que TRAF2 tiene un rol crítico en esta respuesta. La situación emergente en el caso de células deficientes en RIP es inversa: la activación de NFk B por TNF está ausente mientras que la activación de JNK permanece intacta. En consecuencia, RIP es requerido para el acoplamiento de TNFR1 a NFk B pero no sería crucial para acoplar TNFR1 a JNK. Tanto los ratones knock-out TRAF2 como RIP poseen patologías que no pueden ser adscriptas a defectos en el señalamiento del TNF, lo que sugiere que cada una de estas proteínas posee funciones adicionales. TRAF2 une a cIAP1 y cIAP2 (cellular inhibitor of apoptosis-1 & -2) que pertenecen a la familia de las proteínas virales de mamíferos que exhiben actividad anti-apoptótica.

El FADD acopla el complejo TNFR1-TRADD activando a la caspasa-8, e iniciando la apoptosis. Células de ratones knock-out para FADD son resistentes a apoptosis inducida por TNF, demostrando un rol obligatorio de FADD en esta respuesta. Además del FADD, el TNFR1 puede "engranar" un adaptador llamado RAIDD o CRADD. El RAIDD une a través de un dominio de muerte de RIP y a través de un motivo CARD, a una secuencia en el efector de muerte caspasa-2, induciendo de esta forma, la apoptosis.

Señalamiento por DR3

DR3 muestra estrechas similitudes a TNFR1. La sobre-expresión, DR3 dispara respuestas que recuerdan a las producidas por TNFR1, especialmente la activación de NFk B y apoptosis. Similar a lo que ocurre con TNFR1, DR3 activa NFk B (supervivencia) a través de TRADD, TRAF2 y RIP e induce apoptosis a través de TRADD, FADD y caspasa-8 (Fig. 2) DR3 une Apo3L, que está estrechamente relacionado a TNF. Apo3L activa NFk B a través de TRADD, TRAF2, RIP y NIK y dispara la apoptosis a través de TRADD y FADD. Así, en relación con la regulación de NFk B y apoptosis, Apo3L recuerda al TNF. Sin embargo, hay notables diferencias en la expresión de estos ligandos y receptores. La expresión de TNF ocurre principalmente en linfocitos y macrófagos activados, mientras que el ARNm de Apo3L se expresa constitutivamente en muchos tejidos. Inversamente, TNRF1 se expresa ubicuamente, mientras que DR3 está presente principalmente en el bazo, el timo y la sangre periférica y son inducidos por la activación de las células T. A pesar del solapamiento de los mecanismos de señalización, las interacciones Apo3L-DR3 y TNF-TNFR1 probablemente poseen diferentes roles biológicos.

Señalización por DR4 y DR5, modulación por receptores Decoy (señuelo)

Un miembro de la familia del TNF que muestra las mayores similitudes al CD95 fue identificado independientemente por dos grupos quienes los denominaron TRAIL o Apo2. Como ocurre con CD95, Apo2 dispara apoptosis rápida en muchas líneas de células tumorales. A diferencia de CD95, que está restringido principalmente a células T activadas, a células natural killer y a sitios inmunoprivilegiados, la expresión de RNAm de Apo2 es constitutiva en muchos tejidos; sin embargo, como con CD95, la transcripción de Apo2L es elevada en células T de sangre periférica. Un subconjunto de células T maduras adquiere sensibilidad a la apoptosis inducida por Apo2L después de estimulación con interleuquina-2 sugiriendo que Apo2L podría jugar algún rol en la substracción de las células T periféricas. Además, las células T de individuos infectados con el virus de HIV muestran una sensibilidad incrementada a Apo2L, implicando a este ligando, en la destrucción de las células infectadas con el virus.

La inducción de apoptosis por Apo2L requiere de la actividad de caspasas. Sorpresivamente, la expresión ectópica de FADD-DN en cantidades suficientes para bloquear la muerte celular inducida por CD95, no bloquea la inducción de apoptosis por Apo2L, lo que sugiere que un patrón independiente de FADD liga Apo2L a las caspasas. La sobre-expresión de DR4 o DR5, que unen a Apo2L, disparan apoptosis; sin embargo, hay reportes conflictivos sobre el efecto de la transfección en esta respuesta: algunos investigadores no han observado efectos, mientras que otros, observaron inhibición. El desacuerdo, se extiende también a la capacidad del DR4 o del DR5 para unir a adaptadores conocidos. Algunos experimentos no muestran tales interacciones, mientras otros muestran unión a TRADD, FADD, TRAF2 y RIP. A pesar de la interacción observada en experimentos de co-transfección, es posible que las cantidades anormalmente altas de receptores y adaptadores lleve a la asociación homofílica promiscua entre dominios que no interactúan fisiológicamente. Células provenientes de ratones FADD deficientes, que son resistentes a ser inducidos por CD95, TNFR1 y DR3 a sufrir apoptosis, responden totalmente a DR4, confirmando la existencia de una vía independiente de FADD que acopla Apo2L a caspasas (Fig. 3).

Similar al RNAm para Apo2L, los transcriptos de DR4 y DR5 son expresados en varios tejidos, sugiriendo que podría haber mecanismos que protejan a las células de la inducción a sufrir apoptosis por Apo2L. Un tipo de protección está basada en un conjunto de receptores Decoy o señuelo (DcRs), que compiten con DR4 y DR5 para unir Apo2L. DcR1 (también denominado TRID, TRAIL-R3, o LIT), es una proteína glicosil-fosfatidilinositol (GPI) anclada a la superficie de la membrana que recuerda a DR4 y DR5, pero carece de una cola citoplasmática. DcR1 une a Apo2L, y su transfección en células sensibles a Apo2L, reduce substancialmente la respuesta al ligando. El tratamiento de células portando DcR1 con una fosfolipasa, que cliva la GPI de anclaje resulta en una marcada sensibilización a apoptosis inducida por Apo2L. Así DcR1 parece funcionar como un señuelo que previene la unión de Apo2L a su receptor de muerte. DcR2 (también llamado TRAIL-R4 o TRUNDD) es otro receptor que recuerda a DR4 o DR5, pero posee un dominio de muerte citoplasmático substancialmente truncado. Cuatro de seis posiciones de aminoácidos que son críticas para desencadenar apoptosis y para activar NFk B vía TNFR1, están ausentes en DcR2. La transfección de DcR2, inhibe la inducción de apoptosis por Apo2L; la substracción de la región citoplasmática del DcR2 no cancela la actividad inhibitoria, indicando que este receptor actúa como un señuelo que compite con DR4 y DR5 para unir Apo2L. La sobre-expresión de DcR2 activa el NFk B en un estudio pero no en otro; mientras que aún no ha sido investigado si el ligando por sí mismo estimula al NFk B a través de DcR2. El hecho que los genes que codifican a DR4, DR5, DcR1 y DcR2 se encuentren todos juntos en los cromosoma humano 8p21-22, sugiriere que se habrían originado de gene ancestral común. Ha sido reportado que un homólogo del TNFR llamado osteoprotegerina, que se encuentra en el cromosoma humano 8q23-24 y que no está estrechamente relacionado al último cuarto receptor, une Apo2L e inhibe su función, pero la interacción no ha sido unánimemente observada.

La idea de someter al disparo de los receptores de la muerte para inducir apoptosis en cáncer es atractiva, debido a que éstos tienen acceso directo a la maquinaria de las caspasas. Más aún, a diferencia de la mayoría de los agentes quimioterapéuticos o la radioterapia, los receptores de la muerte inician apoptosis independientemente del supresor génico p53, que está inactivado por mutación en más de la mitad de los cánceres humanos. A pesar de estas ventajas, la utilidad clínica tanto de TNF como del CD95L ha sido pobre por los efectos tóxicos laterales. La administración sistémica de ciertas dosis de TNF, causa un síndrome de respuesta inflamatoria que recuerda el shock séptico. Esto parece deberse a la inducción de genes proinflamatorios en macrófagos y células endoteliales a través de la activación de NFk B. La inyección de un anticuerpo agonista de CD95 en ratones portadores de tumores puede ser letal, aparentemente por la inducción de apoptosis en los hepatocitos, células que se sabe expresan CD95 abundantemente. Varias diferencias entre Apo2L y TNF o CD95L sugieren que Apo2L podría ser un agente más adecuado. Primero aunque DR4 y DR5 pueden activar NFk B en condiciones de sobre-expresión, Apo2L en si mismo, induce esta respuesta débilmente, y la activación requiere de dosis que son considerablemente más altas que las dosis de TNF que activan una fuerte respuesta de NFk B. Segundo, muchos tejidos expresan constitutivamente RNAm para Apo2L. Tercero, DR4 y DR5 son expresados en tejidos normales y en muchos tipos de células tumorales, mientras que DcR1 y DcR2 son expresadas frecuentemente en tejidos normales pero no son frecuentes en células tumorales. Esta expresión diferencial, de receptores señuelo y de muerte, puede hacer de Apo2L un agente para inducir apoptosis en células tumorales, pero no en células normales.

Perspectivas Futuras

Las investigaciones recientes han hecho substanciales progresos en el delineado de las vías de señalización que acoplan CD95 y TNFR1 a efectores downstream. Los mismos principios básicos probablemente se pueden aplicar al señalamiento por los más recientemente descubiertos DR3, DR4 y DR5. Pese a que los elementos de señalización usados por DR3 y TNFR1 son similares, sin embargo, la vía desde DR4 y DR5 a caspasas parece distinta, y sus componentes moleculares aún deben ser identificados en células no transfectadas. Un número de cuestiones interesantes hacen necesarios estudios más profundos: ¿Cuales son los roles biológicos de los receptores de la muerte recientemente descubiertos? ¿Los defectos en los receptores y sus ligandos, pueden contribuir a la enfermedad? ¿Qué role/s tiene FADD en el desarrollo embrionario y en la proliferación de células T inducidas por activación? Estos serían particularmente intríngulis a dilucidar, así como el por qué una familia de receptores señuelos de muerte modulan la función Apo2L.