CIENCIAS BASICAS

ROL Y MECANISMOS SUBCELULARES DEL OXIDO NITRICO EN LA REGULACION DE LA CONTRACTILIDAD MIOCARDICA*

MARTIN G. VILA PETROFF

* Trabajo publicado a través del Comité de Ciencias Básicas de la Federación Argentina de Cardiología.
Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina.
Dirección postal: Dr. Marín G. Vila Petroff. Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Facultad de Ciencias Médicas. 60 y 120. 1900 La Plata. Buenos Aires. Argentina.
e-mail: mvila@atlas.med.unlp.edu.ar

Summary

Durante las últimas dos décadas se ha demostrado que la molécula de óxido nítrico (NO) es un modulador endógeno de importantes procesos fisiológicos, incluyendo la relajación vascular dependiente del endotelio, la comunicación química entre nervios periféricos y músculo liso, la agregación plaquetaria, la respuesta inmune y la neurotransmisión. En los últimos años han aparecido muchos trabajos describiendo las múltiples acciones del NO y de los donantes de NO sobre la contractilidad cardíaca. En este artículo revisaremos y sintetizaremos los más recientes descubrimientos sobre la amplia gama de efectos del NO sobre la contractilidad miocárdica, en un intento por discriminar cuáles son los efectores subcelulares involucrados y establecer si las distintas respuestas contráctiles observadas pueden atribuirse a la activación diferencial de mecanismos dependientes o independientes de GMPc.

Rev Fed Arg Cardiol 29: 501-507, 2000

 

Las primeras evidencias del rol del óxido nítrico (NO) como un compuesto biológicamente activo provienen de estudios en el músculo liso vascular, en los cuales se demostró que actúa como un factor relajante1,2. Posteriormente se describieron acciones de este compuesto en el músculo esquelético3 y cardíaco4. Los efectos del NO sobre el músculo liso y esquelético son fascinantes pero escapan al alcance de esta revisión, de modo que en el presente artículo nos ocuparemos de los efectos biológicos del NO en el músculo cardíaco.

El NO es un radical libre gaseoso que es sintetizado in vivo por una familia de enzimas denominadas NO sintasas (NOS). Estas enzimas catalizan la reacción entre el aminoácido L-arginina y el oxígeno produciendo NO y L-critrulina. En el músculo cardíaco se han identificado por lo menos 3 isoformas de la NOS5. Dos de ellas (cNOS1 y cNOS3) se encuentran en el citosol, son constitutivas, Ca2+/calmodulina-dependientes y sólo producen cantidades significativas de NO cuando son activadas por una elevación del Ca2+ intracelular. La isoforma restante (NOS2 o iNOS) es inducible e insensible al Ca2+. La expresión de esta enzima es inducida por la liberación endógena de citoquinas proinflamatorias y endotoxinas. Una vez expresada, la iNOS produce grandes cantidades de NO que han sido implicadas en las consecuencias patológicas observadas durante el shock séptico y la endotoxemia. Entre las isoformas constitutivas, la NOS3 se encuentra ampliamente expresada en miocitos cardíacos y en el endotelio vascular y posiblemente sea la responsable de la mayoría de los efectos fisiológicos del NO en el músculo cardíaco.

Efectos fisiológicos del NO en el corazón
La mayor parte del NO en el corazón es producido por las células del endotelio vascular, y su liberación sustentaría primariamente una función autorregulatoria al promover la relajación del músculo liso vascular y, en consecuencia, modulando el tono y el flujo coronario. Recientemente ha sido demostrada la liberación de NO desde las células endoteliales cardíacas (endocardio) y su producción por los propios miocitos cardíacos.

El NO proveniente del endotelio vascular y cardíaco (producción paracrina)6,7 o de los miocitos cardíacos (producción autocrina) podría participar en la regulación de la contractilidad y relajación miocárdicas8,9. Pinsky y col8, usando un microsensor porfirínico, demostraron que el NO es liberado de manera pulsátil (latido a latido) desde el endotelio cardíaco y su liberación aumenta cuando se incrementan las condiciones de carga del corazón. De esa manera, el NO liberado podría facilitar la relajación miocárdica proveyendo un mecanismo autorregulatorio para la relajación dependiente de la carga. Teniendo en cuenta las distintas fuentes de producción del NO (Figura 1), la concentración del mismo en contacto íntimo con los miocitos podría variar considerablemente y esto podría explicar, al menos en parte, la multiplicidad de acciones del NO sobre la contractilidad miocárdica descripta hasta el presente. Hasta hace poco tiempo el consenso general era que en preparaciones cardíacas aisladas, el NO producía un efecto inotrópico negativo4,10. Sin embargo, estudios subsiguientes revelaron que cuando el NO era administrado en concentraciones fisiológicas (0,1-1 µM) o cuando era elevado de manera aguda mediante la infusión intracoronaria de donantes del NO (nitroprusiato sódico 80 ng/ml o nitroglicerina 40 µg/ml) no estaba asociado con un efecto inotrópico negativo11,12. Más aún, se demostró que bajo ciertas condiciones los donantes de NO en bajas dosis producían un efecto inotrópico positivo13-15. Usando corazones perfundidos de rata, Muller Strahl y col15 demostraron que concentraciones fisiológicas (1µM) de NO en la circulación coronaria estaban asociadas con un significativo mejoramiento de la función contráctil mientras que concentraciones mayores (terapéuticas, > 30 µM) estaban asociadas con un descenso de la contractilidad. En miocitos aislados de rata la administración de altas dosis de SNAP (100 µM), un donante de NO, produce un efecto inotrópico negativo mientras que bajas concentraciones del donante (1 µM) están asociadas con un efecto inotrópico positivo (Figura 2). El NO produce, además, atenuación de la respuesta a la estimulación betaadre­nérgica16, modulación de la relación fuerza-frecuencia17 y de la relación fuerza-longitud18. A pesar de estos efectos múltiples y muchas veces contradictorios, la mayoría de las respuestas mediadas por el NO en el corazón han sido atribuidas a la activación de una guanilato ciclasa soluble (GC) y la subsiguiente elevación del GMP cíclico (GMPc) intracelular y la activación de la proteína quinasa GMPc-dependiente (PKG).

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Figura 1. Esquema de las posibles fuentes de producción de NO en el corazón. Las NO sintasas se encuentran en el endocardio, en el endotelio coronario y en el propio miocito. La cNOS es activada por el aumento del Ca2+ producido por, entre otros, el ciclo contráctil o el estímulo mecánico producido por el esfuerzo de corte. La expresión de la iNOS es estimulada por la respuesta inmune a toxinas bacterianas o por la presencia de citoquinas proinflamatorias. La sobreproducción de NO generado por estos estímulos puede tener profundos efectos sobre la contractilidad miocárdica.

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Figura 2. Efecto opuesto de altas y bajas concentraciones del donante de NO, SNAP, sobre la contracción en miocitos aislados. A: El registro superior muestra la progresiva disminución en la amplitud de contracción producida por una alta (100 µM) concentración de SNAP mientras que el registro inferior muestra el efecto inotrópico positivo producido por una baja (1µM) concentración del donante. Tanto el aumento como la disminución de la respuesta contráctil producida por SNAP se revierten completamente con el lavado. B: Valores promedio del curso en el tiempo de los efectos de altas y bajas concentraciones de SNAP sobre la amplitud de contracción (n = 5). Modificado de Vila Petroff y col. Circ Res 84: 1020-1031, 1999.

Mecanismos subcelulares del NO dependientes del GMPc
El incremento de los niveles intracelulares de GMPc inducido por el NO ha sido demostrado inequívocamente en miocitos cardíacos aislados. Kodja y col13 demostraron que el SNAP (100µM), un donante del NO, puede aumentar el nivel de GMPc basal aproximadamente 8 veces. Estos resultados son consistentes con los obtenidos en estudios más recientes, en los que se encontraron aumentos significativos de GMPc usando concentraciones altas (100µM) y bajas (1 µM) de SNAP14. En un elegante estudio de Shah y col19 se demostró que la aplicación de un análogo del GMPc, el 8-bromo-GMPc, a miocitos cardíacos aislados, producía un efecto inotrópico negativo. Debido a que este efecto se producía sin cambios en el Ca2+ intracelular, el efecto inotrópico negativo del 8-bromo-GMPc fue atribuido a una disminución en la respuesta al Ca2+ de las proteínas contráctiles. De manera similar a estos resultados obtenidos con el 8-bromo-GMPc, la administración del SNAP (100µM) a miocitos aislados produce un efecto inotrópico negativo sin cambios en el Ca2+ intracelular (Figura 3). Una disminución en la respuesta a Ca2+ de las proteínas contráctiles mediada por GMPc también ha sido demostrada usando fibras cardíacas permeabilizadas20. Aunque no existen evidencias directas, el mecanismo más probable para explicar la disminución en la respuesta al Ca2+ de las proteínas contráctiles, sería una fosforilación de la troponina I (TnI) mediada por PKG. Sustentando a este mecanismo, distintos estudios han demostrado que la PKG fosforila a la TnI en el mismo sitio fosforilado por la proteína quinasa AMPc-dependiente (PKA) siendo conocido que esta quinasa, a través de la fosforilación de la TnI reduce la afinidad de la troponina C por el Ca2+ 21.

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Figura 3. Efecto inotrópico negativo inducido por una elevada concentración del donante NO, SNAP 100 µM, en un miocito aislado cargado con el indicador de Ca2+ Indo-1. El registro continuo del acortamiento celular muestra la disminución progresiva de la amplitud de contracción producida por el SNAP. Los trazos inferiores muestran, en una escala expandida, las variaciones del Ca2+ intracelular (fluorescencia del indo-1) y de la longitud celular durante las contracciones individuales registradas en el control (a), y luego de 5 (b) y 15 (c) minutos de aplicación de SNAP. La reducción en la amplitud de la contracción no está asociada con una reducción del Ca2+ intracelular. Modificado de Vila Petroff y col. Circ Res 84: 1020-1031, 1999.

Un cambio en la respuesta al Ca2+ de las proteínas contráctiles es uno de los dos mecanismos básicos a través de los cuales se puede regular la contractilidad miocárdica. El otro es una variación del Ca2+ intracelular. Este segundo mecanismo también ha sido propuesto para explicar los cambios de contractilidad producidos por NO22. En estos estudios se observó que los donantes de NO y el GMPc pueden reducir la entrada de Ca2+ a través de los canales de Ca2+ tipo L. Debido a que la entrada de Ca2+ a través de los canales L sirve de gatillo para la liberación de una mayor cantidad de Ca2+ del retículo sarcoplasmático (SR), la disminución de la corriente de Ca2+ mediada por NO/GMPc podría tener un impacto significativo en la cantidad de Ca2+ liberada hacia los miofilamentos y, por lo tanto, contribuir a la respuesta inotrópica negativa del NO. Los mecanismos por los cuales el aumento del GMPc inducido por NO podrían modular la corriente de Ca2+ son controvertidos, hasta el presente. En miocitos aislados de sapo y en células auriculares humanas, el GMPc produce una disminución de la corriente lenta de Ca2+ tipo L debido a un descenso de los niveles basales del AMP cíclico (AMPc). Este fenómeno es producido por la activación GMPc-dependiente de la fosfodiesterasa del AMPc (PDE tipo II) que degrada al AMPc23. En cardiomiocitos de rata se ha demostrado que el GMPc modula la actividad de la corriente de Ca2+ tipo L mediante un mecanismo que no involucra cambios en el AMPc intracelular24. La Figura 4 muestra un esquema del posible balance entre las rutas metabólicas del GMPc y del AMPc a altas concentraciones de NO.

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Figura 4. Esquema de las posibles rutas metabólicas activadas por altas concentraciones de NO. Las altas concentraciones de NO están asociadas con un efecto inotrópico negativo que podría ser el resultado de la activación de la GC con la subsiguiente formación de GMPc. Este nucleótido cuando se eleva considerablemente podría activar por un lado a la PKG que fosforilaría distintas proteínas celulares, como por ejemplo proteínas contráctiles y/o canales de Ca2+ tipo L, produciendo una disminución en la respuesta al Ca2+ de las proteínas contráctiles y/o una disminución del Ca2+ intracelular, o por el otro podría activar a la PDE tipo II que degradaría el AMPc endógeno.

Como se ha mencionado previamente, bajo ciertas condiciones el NO es capaz de producir aumentos de contractilidad miocárdica aunque los mecanismos subcelulares que subyacen a este aumento están lejos de ser comprendidos. En general, el efecto inotrópico positivo ha sido observado cuando se emplearon bajas concentraciones de donantes de NO, en contraste con el efecto inotrópico negativo que, en general, se ha visto asociado con altas concentraciones de NO. En miocitos cardíacos aislados, la administración de una baja dosis del donante de NO, SNAP (1µM) produce un pronunciado efecto inotrópico positivo asociado con un significativo aumento del Ca2+ intracelular (Figura 5). Se ha sugerido (en contraste con la activación GMPc-dependiente de la PDE tipo II mencionada previamente, y que se observa sólo con altas concentraciones de GMPc) que el aumento del Ca2+ observado con bajas concentraciones de NO podría ser el resultado de un aumento del AMPc intracelular y de la activación de PKA. En este caso, el aumento de AMPc podría deberse a una inhibición GMPc-dependiente de otra fosfodiesterasa: la fosfodiesterasa tipo III (PDE tipo III). De hecho, bajas concentraciones de GMPc (0,1 a 10 µM) o del donante de NO SIN-1 (0,1-10mM) inducen la estimulación de la corriente de Ca2+ tipo L25. Debido a que esta activación de la corriente de Ca2+ mediada por SIN-1 podía ser abolida por milrinona, un inhibidor específico de las PDE tipo III, los autores interpretaron estos resultados como indicativos de que la acción estimulatoria del SIN-1 sobre la corriente de Ca2+ tipo L era mediada por la inhibición GMPc dependiente de la PDE III. De esta forma, la inhibición de la degradación de AMPc mediada por la inactivación de la PDE tipo III, observada sólo cuando se acumulan bajos niveles de GMPc, favorece la estimulación AMPc/PKA-dependiente de la corriente de Ca2+ y da como resultado una mayor liberación de Ca2+ del RS y un efecto inotrópico positivo.

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Figura 5. Efecto inotrópico positivo inducido por una baja concentración del donante de NO, SNAP 1 µM, en un miocito aislado cargado con el indicador de Ca2+ Indo-1. El registro continuo del acortamiento celular muestra el aumento progresivo de la amplitud de contracción producida por el SNAP. Los trazos inferiores muestran, en una escala expandida, las variaciones del Ca2+ intracelular (fluorescencia del indo-1) y de la longitud celular durante las contracciones individuales registradas en el control (a), y luego de 5 (b) y 15 (c) minutos de aplicación de SNAP. El donante de NO, SNAP, produjo un aumento paralelo de la amplitud de la contracción y del Ca2+ intracelular. Modificado de Vila Petroff y col. Circ Res 84: 1020-1031, 1999.

Sin embargo, una disminución en la actividad de las PDE tipo III sería sólo uno de los dos posibles mecanismos capaces de aumentar el AMPc intracelular, siendo el otro una activación de la adenilato ciclasa (AC). En una publicación reciente14 hemos demostrado que, en presencia de un inhibidor selectivo de la GC, el ODQ, capaz de abolir completamente el aumento de GMPc, el donante de NO, SNAP (1µM) producía un efecto inotrópico positivo en miocitos aislados de rata. Además, este efecto estaba asociado con un aumento del AMPc intracelular y con la activación de la AC. Estos resultados sugieren que el AMPc puede ser aumentado por un mecanismo independiente de la inhibición de la PDE III por GMPc y que, posiblemente, involucre la activación directa de la AC por el NO. La Figura 6 muestra un esquema del posible balance entre las rutas metabólicas del GMPc y del AMPc producido a bajas concentraciones de NO.

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Figura 6. Esquema de las posibles rutas metabólicas activadas por bajas concentraciones de NO. Las bajas concentraciones de NO están asociadas con un efecto inotrópico positivo. Este efecto resultaría de un aumento del AMPc intracelular producido por la inhibición de la PDE tipo III, mecanismo que sólo se produce cuando se acumulan bajos niveles de GMPc. El aumento del AMPc intracelular también podría deberse a la activación directa de la AC por NO.

Los resultados discutidos hasta el momento indican que existe una gran variabilidad en la respuesta contráctil al NO en el miocardio. Es posible que la variabilidad observada se deba a diferencias entre especies, pero debe atribuirse más probablemente a una variación en la cantidad de NO aportada a los distintos efectores intracelulares.

En cuanto a los mecanismos subcelulares involucrados en las múltiples respuestas al NO observadas, la interpretación clásica de que todos los efectos fisiológicos del NO son mediados por la activación de la vía GMPc/PKG resulta demasiado simplista. A tal punto que la multiplicidad de respuestas del NO en el miocardio ha generado la sospecha de que no todas las acciones del NO pueden ser mediadas por mecanismos GMPc/PKG-dependientes. De hecho, recientes resultados evidencian la existencia de nuevas vías de señalización del NO que serían independientes del GMPc y que serán revisadas en la siguiente sección.

Mecanismos subcelulares del NO independientes del GMPc
El NO es considerado un radical libre, ya que posee un electrón libre en su orbital más externo. Sin embargo el NO no es una especie altamente reactiva comparado con otros radicales libres más conocidos, como el superóxido O2- o el hidroxilo OH-, y sólo reacciona con un grupo selectivo de moléculas. Entre otros, el NO puede reaccionar con oxígeno dando dióxido de nitrógeno. La formación de este compuesto en los sistemas biológicos es extremadamente lenta y, por lo tanto, no sería el candidato responsable de las acciones fisiológicas del NO26.

Otra reacción natural y habitual del NO es la formación de S-nitrosotioles (SNO). Estos compuestos han sido implicados en muchas de las propiedades biológicas del NO, fundamentalmente en su propiedad de poder unirse covalentemente a componentes críticos de proteínas celulares, como son los tioles y/o los metales de transición, pudiendo modificar así la función de las proteínas27.

Por último, el NO puede combinarse con O2- generando un compuesto altamente oxidante, el peroxinitrito (ONOO-) que ha sido asociado con muchas de las acciones patológicas atribuidas al NO.

A pesar de que estas reacciones están bien documentadas, sólo recientemente la oxidación y S-nitrosilación de tioles y proteínas han sido implicadas en la regulación del acoplamiento éxcito-contráctil cardíaco. Las primeras evidencias mostraron una inhibición reversible de la corriente de Ca2+ tipo L por agentes modificadores de sulfidrilos. Estos resultados dieron origen a la hipótesis de que una S-nitrosilación mediada por NO o por donantes del mismo, podría tener efectos similares sobre la corriente de Ca2+ 28. Posteriormente, Campbell y col29 demostraron, usando miocitos ventriculares de hurón, la activación reversible de los canales de Ca2+ tipo L mediada por una S-nitrosilación, y concluyeron que el estado redox del sarcolema puede directa y selectivamente modular la corriente de Ca2+ tipo L.

Además del influjo de Ca2+, otro mecanismo de singular importancia como determinante del acoplamiento éxcito-contráctil y de la fuerza de contracción cardíaca es la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplasmático a través de los canales de Ca2+ sensibles a rianodina, o receptores de rianodina (RR). La presencia de tioles regulatorios en estos canales de rianodina ha sido descripta previamente30. Además, se ha demostrado que varios agentes oxidantes químicos activan a este canal mientras que los agentes reductores revierten este efecto. Por lo tanto, un mecanismo regulatorio semejante podría ser propuesto para el control de los canales de rianodina por el NO.

Stoyanovsky y col31 demostraron que cuando el NO es administrado como gas, como S-nitrosotioles o como compuestos libres de sulfuro, puede oxidar o nitrosilar tioles regulatorios en el RR, resultado en la apertura de los canales y liberación de Ca2+ del RS. Además, estos efectos pueden ser completamente revertidos por agentes reductores. Xu y col32 llevaron estos estudios un paso más adelante, y mostraron que los RR pueden ser activados reversiblemente cuando son S-nitrosilados, mientras que las condiciones que elevan el estrés oxidativo producen la inactivación irreversible y la pérdida del control de los mismos.

En suma, estos resultados permiten la formulación de nuevas hipótesis en las cuales el NO podría regular dinámicamente el acoplamiento éxcito-contráctil y la contractilidad cardíaca mediante la modulación de la actividad de los canales de Ca2+ tipo L y/o de los RR.

CONCLUSION
Los efectos del NO sobre la contractilidad así como los mecanismos subcelulares involucrados son evidentemente multifacéticos. Además, queda claro que no se pueden atribuir las diversas acciones del NO simplemente a la activación diferencial de vías GMPc-dependientes o independientes. Más probablemente, la respuesta celular al NO dependerá de la concentración del gas alcanzada, de la localización subcelular del mismo, de las estructuras celulares involucradas y del balance final alcanzado entre los procesos dependientes e independientes de GMPc.

Basado en la variabilidad de los resultados experimentales obtenidos hasta el momento, la comprensión del rol del NO en la regulación de la contractilidad en el corazón humano requerirá nuevos estudios y el desarrollo de técnicas más sofisticadas. Sin embargo resulta atractivo, teniendo en cuenta la información preexistente, atribuir al NO endógeno una función de soporte de la contractilidad miocárdica, mientras que dosis farmacológicas del mismo estarían asociadas con efectos cardiodepresores.

SUMMARY
ROLE AND SUBCELLULAR MECHANISMS OF NITRIC OXIDE IN THE REGULATION OF CARDIAC CONTRACTIBILITY
During the last two decades the ubiquitous signalling molecule, nitric oxide (NO), has been shown to play a key role in many important cellular processes, including endothelium dependent relaxation of blood vessels, chemical communication between peripheral nerves and smooth muscle, inhibition of platelet aggregation, immune responses and neurotransmission.  More recently, a large body of information has appeared, addressing the apparently multiple effects of NO and NO donors on myocardial contractibility and, unfortunately, these finding have often been seemingly contradictory. In this article we will review, and provide a synthesis, of the most recent findings on the wide range of actions of NO on myocardial contractibility, in an attempt to discriminate the down stream effectors, and to establish  whether the multiple contractile responses to NO may be attributed to the activation of distinct cGMP-dependent or independent mechanisms.

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Publicación: Diciembre 2000

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