ARTICULOS ORIGINALES

MIOCARDIOPATIA DILATADA ALCOHOLICA, INSUFICIENCIA CARDIACA Y APOPTOSIS

HECTOR L. BALBARREY*, JUAN C. PICENA**, EDGARDO E. GUIBERT***

* Centro Médico IPAM
** Cátedra de Anatomía y Fisiología Patológicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Rosario
*** Biología Molecular, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario.
Dirección postal: Dr. Héctor L. Balbarrey. Centro Médico IPAM. Sarmiento 3125. 2000 Rosario. Santa Fe. Argentina.

Recibido: Julio de 1998
Aceptado: Agosto de 1998

Summary

Resumen: La insuficiencia cardíaca congestiva (ICC) severa es un síndrome multisistémico, de pronóstico sombrío. Los mecanismos celulares responsables del deterioro progresivo de la función miocárdica son poco claros y podrían atribuirse, en parte, a la presencia de apoptosis (muerte celular programada). El objetivo de este trabajo fue realizar una revisión retrospectiva de pacientes (p) fallecidos hace 30 años en el Hospital Nacional del Centenario de Rosario, con ICC producida por miocardiopatía dilatada alcohólica (MDA) y la búsqueda de apoptosis. De 14 p masculinos con ICC con clasificación funcional NYHA 0 = 3,28, fallecieron 6. Se obtuvieron necropsias de 5 p (edad media: 39 ± 2 años), cuya evolución a la muerte desde la última internación por ICC fue de 0 = 9,7 ± 2,1 meses. Las necropsias fueron estudiadas desde tres aspectos: a) revisión y análisis de los datos consignados en las fichas clínicas originales; b) revisión anatomopatológica de cortes histológicos obtenidos de tacos de parafina preservados en la Cátedra de Anatomía y Fisiología Patológicas, Facultad de Ciencias Médicas, UNR; c) detección in situ de apoptosis por fragmentación de ADN nuclear con fluoresceína 11-dUTP e incorporado por transferasa terminal y coloración específica con DAPI, compuesto fluorescente que se intercala entre las bases adenina y timina del ADN. Fueron utilizadas como controles muestras de otros tres pacientes que fallecieron hace treinta años sin patología miocárdica. La revisión de las historias clínicas confirmó el diagnóstico original y en el estudio anatomopatológico la observación detallada permitió establecer la presencia de imágenes de apoptosis, lo cual fue confirmado por reacciones específicas para detectar el ADN fracturado. En conclusión, la nueva metodología disponible, aplicada a muestras conservadas aproximadamente por 30 años, permite deducir que en la MDA con ICC la apoptosis está presente. Este fenómeno sería inducido como respuesta celular a la agresión y podría contribuir al deterioro y muerte de estos pacientes.

Rev Fed Arg Cardiol 27: 453-460, 1998

Hace aproximadamente 30 años fueron estudiados en el Hospital Nacional del Centenario de la ciudad de Rosario (Santa Fe), 24 pacientes con miocardiopatía alcohólica 1. Entendemos por miocardiopatía alcohólica la lesión determinada por acción directa del alcohol sobre la fibra miocárdica 2-4.

El diagnóstico se realizó por el antecedente de ingestión de alcohol en grandes cantidades: de 3 a 5 litros de bebidas de gradación alcohólica aproximada a los 12° (vino) y de 250 ml de bebidas de alta graduación alcohólica (bebidas destiladas, de 45° a 55°) por día y en forma continuada durante por lo menos 5 años. Se excluyeron otras causas conocidas de miocardiopatías, como la producida por enfermedad de Chagas, hipertensión arterial, cardiopatía reumática, cardiopatías congénitas, ateromatosis coronaria y valvulopatías 3.

En 10 pacientes la abstinencia del alcohol fue seguida de la desaparición de los síntomas y signos cardiovasculares en pocas semanas. A este grupo de pacientes con alteraciones reversibles se lo denominó Grupo o Estadio I.

En los 14 pacientes restantes (Grupo o Estadio II), con síntomas y signos de insuficiencia cardíaca severa, la evolución fue hacia el deterioro progresivo y el daño irreversible, provocando la muerte en 6 pacientes en el término de 1 año después de la última internación. En 5 de ellos se realizaron autopsias y constituyen el material de análisis de este estudio.

Desde que Kerr, Wyllie y Currie describieron las bases biológicas del fenómeno de apoptosis y sus implicancias en la fisiología humana, numerosos trabajos han sido presentados para comprobar la existencia de este fenómeno en diferentes procesos fisiopatológicos 5. Existen dos tipos principales de muerte celular: apoptosis y necrosis. Apoptosis o su expresión más actual de muerte celular programada, es un proceso activo que cumple un papel primordial en la organogénesis embrionaria y en el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos en etapa adulta 6,7. Este es un proceso genéticamente controlado y puede ser activado por un reloj interno o por agentes extracelulares, tales como hormonas, citoquinas, especies reactivas del oxígeno y agentes tóxicos como el alcohol 8,9. Necrosis es un proceso pasivo, accidental, causado por la acción degradante de enzimas hidrolíticas en las células muertas 10. La necrosis ocurre en respuesta a una hipoxia muy severa, isquemia, hipertermia, infección viral o a la exposición de una variedad de agentes químicos o físicos.

De acuerdo con el trabajo de Narula y col 11, quienes postulan que la apoptosis es uno de los mecanismos celulares que conducen a estadios finales de la insuficiencia cardíaca, en 1997 pensamos que si tratábamos con técnicas de biología molecular 12-14 los tacos de parafina del material de autopsia de aquellos 5 pacientes, podríamos estar en condiciones de corroborar la presencia de fragmentación nuclear en las imágenes que, con técnicas de microscopía óptica convencional, eran sugestivas de ser cuerpos apoptóticos en el miocardio. Si esto fuera así, a la luz de los nuevos conocimientos adquiridos en relación con el concepto de apoptosis, se explicaría en parte la rápida evolución y el deterioro progresivo, seguidos de muerte, de nuestros pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva (ICC) severa.

La ICC severa es un síndrome multisistémico de diversas etiologías y de pronóstico sombrío. Los mecanismos celulares responsables del agravamiento de la función miocárdica son poco claros y podrían atribuirse, en parte, a la presencia de apoptosis (muerte celular programada).

El objetivo del presente trabajo ha sido realizar una revisión clínica e histopatológica retrospectiva de pacientes fallecidos hace 30 años en el Hospital Nacional del Centenario de la ciudad de Rosario, con ICC, clase funcional III-IV NYHA, producida por miocardiopatía dilatada alcohólica (MDA) y demostrar la presencia de apoptosis.

MATERIAL Y METODO
Pacientes. Las muestras de tejido miocárdico, fijado en formol e incluido en parafina, fueron provenientes de las necropsias de 5 pacientes fallecidos hace aproximadamente 30 años en el Hospital Nacional del Centenario, con ICC, clase funcional III-IV NYHA, producida por MDA. Las de los corazones de otros tres pacientes fallecidos, también hace 30 años, por causas no cardíacas, fueron utilizadas como controles.

El estudio realizado abarcó la combinación de 3 aspectos:
a) clínico: extracción y análisis de los datos consignados en las fichas clínicas de los pacientes;
b) anatomopatológico: consistió en la revisión de los protocolos originales de autopsias y de cortes histológicos obtenidos de tacos de parafina conservados en la Cátedra de Anatomía y Fisiología Patológicas de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNR. Fueron realizados nuevos cortes de 5 µm de espesor, coloreados con técnicas de hematoxilina-eosina (H/E), PAS y tricrómica de Masson. El análisis se llevó a cabo con microscopía óptica;
c) detección in situ de apoptosis a nivel celular: se utilizaron dos procedimientos generales: 1) por coloración directa del ADN nuclear fracturado con 4',6-diamindino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) (Molecular Probes, USA) y 2) por una reacción enzimática que incorpora deoxiuridina-trifosfato (dUTP), marcados con fluoresceína (Fluoresceína-11-dUTP, Promega Corp., USA) a extremos 3Õhidroxilos libres de un ADN fragmentado, por la acción catalítica de la enzima transferasa terminal (deoxiuridil transferasa, TdT), método conocido como TUNEL, de las siglas del método en inglés: TdT-mediated dUTP Nick-End Labelling, marcación de extremos rotos de ADN por transferasa terminal y dUTP. La fluorescencia del ADN puede ser analizada con un microscopio apropiado 7,12,14.

En resumen, los procedimientos consistieron en:
Desparafinación de las muestras. Los portaobjetos con las secciones de tejido miocárdico (7µm) fueron desparafinados con tolueno y rehidratados en alcoholes de distinta graduación. Luego se procede a sumergirlos por 5 min.. en NaCl (0,85%) y 5 min.. en solución salina tamponada (PBS).
Permeabilización de las muestras. Se agregan 100 µl de proteinasa K (20µg/ml; Sigma Chem. Co., S. Louis, USA) cubriendo la superficie total de tejido. Luego de 10 min. a 37°C, se detiene la reacción con PBS (2?5 min.). Posteriormente, los tejidos son nuevamente fijados sumergiéndolos 15 min.. en 4% de formol estabilizado, dos lavados en PBS de 5 min. cada uno y nueva inmersión en 4% de formol estabilizado por 5 min.. Se mantienen las muestras en PBS hasta la siguiente etapa.
Coloración con DAPI. Se incuban las muestras con una solución de DAPI (1 mg/ml) (20 min.-25°C) y luego del montaje de los preparados se analizan en un microscopio óptico con aditamento de fluorescencia y cámara fotográfica (Olympus, BH2-RFCA).
Marcación de ADN fragmentado. Se equilibran las muestras de tejidos en solución reguladora de equilibrio y medio de reacción (200 mM cacodilato de potasio, 25 mM Tris-HCI, 0,2 mM ditioeritritol, 2,5 mM de CoCl2 y 0,25 mg/ml de albúmina bovina, pH = 6,66, a 25°C). Al cabo de 10 min. , cada muestra es incubada (60 min.-37°C, en cámara húmeda y protegidos de la luz) con la mezcla de reacción (solución reguladora de equilibrio suplementada con 10 µl de mezcla de fluoresceína-11-dUTP (50µM) y 10 U/50µl de transferasa terminal). Se detiene la reacción con 2x solución salina de citrato (15 min.-25°C). Dos lavados en PBS eliminan el exceso de nucleótidos modificados no incorporados y las muestras son contrateñidas con ioduro de propidio (1µg/ml) y luego del montaje son analizadas en un microscopio óptico con aditamento de fluorescencia y filtros especiales, como se describió para la coloración con DAPI.

RESULTADOS
La revisión y el análisis de los datos consignados en las fichas clínicas originales confirmaron la etiología alcohólica. De 14 pacientes alcohólicos con ICC severa, clasificación funcional NYHA media de 3,28 y edad promedio de 41,9 años, fallecieron 6 y se realizó autopsia en 5 de ellos (Tabla I). En estos pacientes, la evolución desde la última internación hasta la muerte por ICC fue de 9,7 ± 2,1 meses; ninguno de ellos presentaba caquexia.

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En las necropsias, los corazones de estos pacientes presentaron aumento de peso (entre 400 y 650 g) con hipertrofia y dilatación globales, sin lesiones valvulares ni arteriosclerosis obstructiva de los grandes vasos coronarios (Tabla II).

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El estudio histopatológico reveló áreas de hipertrofia y vacuolización yuxtanuclear de las células musculares cardíacas. El sarcoplasma exhibió degeneración granular, con fragmentación de las miofibrillas (miocitolisis) y depósitos de lipofucsina (Figura 1A). Algunas células cardíacas mostraron incremento de acidofilia citoplasmática con picnosis nuclear sin afluencia de polimorfonucleares neutrófilos en el área (Figura 1B). Ocasionalmente se observaron núcleos deformados, de contornos abollonados, con engrosamiento de su membrana (Figura 1C).

Figura 1. Secciones de miocardio ventricular de pacientes alcohólicos.
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1A. Corte longitudinal donde se destaca la presencia de gránulos de lipofucsina (L) en el citolasma y núcleos con condensación irregular de la cromatina. (H/E,200x)

BalbaF1B.gif (25320 bytes) Figura 1B. Corte oblicuo. La flecha señala una fibra miocárdica adelgazada, con franco aumento de acidofilia citolasmática y picnosis nuclear (Àapoptosis?). (H/E, 200x)
BalbaF1C.gif (25314 bytes) Figura 1C. Corte transversal de fibras miocárdicas con vacuolización citoplasmática dispersa y edema intersticial. Se señala un núcleo picnótico de forma semilunar (Àapoptosis?). (H/E, 200x)
   

La ausencia de arteriosclerosis fue un hecho constante, pero se destacaron alteraciones en los vasos más pequeños. En éstos hubo edema intimal muy marcado y, en ocasiones, depósitos excéntricos de una sustancia grumosa PAS positiva a nivel subintimal. El intersticio mostró edema, más intenso en el subendocardio. Se observó fibrosis interfascicular focal, que en otras zonas se hizo más extensa, llegando a mutilar fibras miocárdicas 1,4. Ninguna de estas alteraciones estuvo presente en los corazones de las muestras control.

La Figura 2A representa la aplicación del TUNEL a una muestra de otro paciente que falleció hace 30 años sin patología miocárdica y fue utilizada como control. En la Figura 2B se observa una fibra miocárdica con fragmentación nuclear con fluorescencia proveniente de una reacción TUNEL positiva. En la Figura 2C, entre las fibras musculares cardíacas teñidas con DAPI se destaca la fluorescencia azul de un núcleo con su cromatina condensada y fragmentada.

Figura 2. Secciones de miocardio ventricular preservados treinta años.
BalbaF2A.gif (27816 bytes) 2A. Muestra control tratada con TUNEL, como se describe en métodos. Se observan gránulos amarillos de lipofucsina (L). Los núcleos, teñidos de color naranja, no presentan fluorescencia. (200x)
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2B. Muestra de un paciente fallecido con MDA e I.C.C., tratada con TUNEL, como se describe en métodos. Se señala el núcleo fluorescente de una célula en apoptosis (200x).

BalbaF2C.gif (22560 bytes) 2C. Muestra de un paciente fallecido con MDA e I.C.C. teñida con DAPI. Se señala el núcleo con fluorescencia azul de una célula en apoptosis (200x).

 

DISCUSION
En la miocardiopatía dilatada alcohólica hay lesiones fibrilares que son comunes a otros trastornos metabólicos. La complejidad del cuadro histológico y las peculiares lesiones de los pequeños vasos, junto con el apoyo de una adecuada observación clínica y el antecedente de un etilismo severo, como observamos en nuestros pacientes, contribuyen al diagnóstico 1,4.

En los últimos cinco años, y a partir del trabajo de Kerr y col 5, quienes definieron un mecanismo muy poco conocido de eliminación controlada de células, el cual cumple un papel complementario, pero opuesto a la mitosis, en la regulación de las poblaciones animales, la descripción de apoptosis en distintos procesos fisiopatológicos ha tenido un incremento notable 15,16, en particular en trabajos relacionados con insuficiencia cardíaca 17-20.

Por consiguiente tratamos de echar una nueva mirada a un antiguo problema. En la revisión histológica destacamos la existencia de células con incremento de acidofilia citoplasmática, sin infiltrado inflamatorio agregado (Figura 1B), así como núcleos voluminosos de contornos abollonados, alternando con imágenes de picnosis. Estos hallazgos cualitativos podrían ser interpretados como figuras de apoptosis 5. Con las reacciones de TUNEL y DAPI (Figuras 2B y 2C) se evidenció la fractura del ADN, confirmando la presencia de apoptosis en esta patología. Si bien reconocemos que ambas técnicas de detección in situ de ADN fragmentado pueden fallar al momento de discriminar entre apoptosis, necrosis y muerte celular por autólisis 21, creemos que la combinación de estos dos métodos de detección de fractura de ADN, sumados al estudio histológico exhaustivo del tejido miocárdico, tanto en la descripción original como en la actual revisión, donde no se observaron figuras histológicas de necrosis, nos permite sugerir que la apoptosis (muerte celular programada) acompañó la falla miocárdica en estos pacientes alcohólicos. Estas imágenes estuvieron ausentes en los controles.

Nuestros resultados coinciden con los trabajos de Narula y col 11 y Olivetti y col 17 en los que se sostiene que la apoptosis está presente en la ICC irreversible en humanos. Esto último podría explicar, en parte, el deterioro progresivo y muerte de nuestros pacientes con MDA e ICC terminal.

Como lo menciona Colucci 19 en su comentario editorial sobre el trabajo de Narula y col 11, quienes hallaron que sólo el 0,2% de las células estaban marcadas por el método de TUNEL 12-14, esta escasa proporción de miocitos afectados podría parecer poco importante en relación con la función cardíaca en sus pacientes con miocardiopatía dilatada e ICC terminal. Sin embargo, como lo destaca Colucci 19, si consideramos que aquellas células están presentes sólo transitoriamente por minutos u horas, puede ser más apropiado calcular el número total de células perdidas a través del tiempo. En efecto, asumiendo que una célula que desarrolla apoptosis es detectable por 24 horas, puede estimarse que una pérdida de un 0,2% de células por día, si persiste por un año, resultaría en una pérdida de más del 50% del total del conjunto de miocitos cardíacos. Esto podría explicar el concepto de muerte celular acelerada, que está presente en la ICC severa y puede estar producida por sobrecarga de presión, de volumen o por lesión intrínseca del miocardio 22.

En conclusión, la nueva metodología disponible, aplicada a muestras conservadas aproximadamente por 30 años, permite deducir que en la miocardiopatía dilatada alcohólica con insuficiencia cardíaca congestiva severa, la apoptosis está presente y sería inducida como respuesta celular a la agresión y podría contribuir al deterioro y muerte de estos pacientes.

 

SUMMARY
ALCOHOLIC DILATED CARDIOMYOPATHY, CONGESTIVE HEART FAILURE AND APOPTOSIS
Background. Severe congestive heart failure (CHF) is a multisystemic syndrome of multiple etiology, with ominous prognosis. The cellular mechanisms responsible for the progressive deterioration of myocardial function in heart failure remain unclear and might be due to apoptosis (programmed cell death).
Objectives. To carry out a retrospective revision of patients deceased 30 years ago at the Hospital Nacional del Centenario, Rosario city, with CHF due to alcoholic dilated cardiomyopathy (ADCM) and the search for apoptosis.
Methods. Six out of 14 male patients (p) with ADCM and CHF, functional classification NYHA 0 = 3,28 died. Necropsies of 5 p were performed (age 39 ± 2 years). The follow up from the last hospitalization due to CHF and death was 0 = 9.7 ± 2.1 months. The necropsies were studied under three aspects: a) revision and analysis of clinical data; b) revision of histopathological findings of sections obtains from paraffin-embedded tissues preserved in Cátedra de Anatomía y Fisiología Patológicas, Facultad de Ciencias Médicas, UNR; c) in situ detection of apoptosis by labelling of DNA strand breaks associated with apoptosis using fluorescein-dUTP and transferase terminal enzyme, and specific DNA stain with DAPI, a fluorescent compound that is intercalated between adenine and thymidine DNA bases. Samples from three other patients without myocardial disease, were used as controls.
Results. The revision of clinical records confirms the original diagnosis. Detailed histopathologic observation revealed the presence of apoptotic bodies, confirmed by specific reactions that detect fractured DNA.
Conclusions. The new methodology available, useful in spite of the elapsed time (30 years), allows us to deduct that in ADCM with CHF, apoptosis is present and might be induced as a cellular response to aggression and could contribute to progressive deterioration and death of these patients.

Agradecimientos
Deseamos agradecer a la Cátedra de Anatomía y Fisiología de la Facultad de Ciencias Médicas por la conservación de las muestras que hicieron posible este estudio y al área de Biología de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la UNR por facilitarnos la utilización del microscopio de fluorescencia.

Bibliografía

  1. Balbarrey HL: Miocardiopatía alcohólica. Tesis de Adscripción a la Cátedra de Cardiología, 1970. Biblioteca del Area de Salud, Facultad de Ciencias Médicas, universidad Nacional de Rosario. Santa Fe 3100, (2000) Rosario, Argentina.
  2. Bridgen W: Uncommon myocardial diseases. The non coronary cardiomyopathies. Lancet 2: 1179, 1957.
  3. Brigden V, Robinson H: Alcoholic heart disease. Brit Med J 2: 1283, 1964.
  4. Pintar K, Wolansky BM, Gubbaye R: Alcoholic cardiomyopathy. Cand Med Ass J 93: 103, 1965.
  5. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR: Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26: 239-257, 1972.
  6. Williams G, Smith C: Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on cell death. Cell 44: 777-779, 1993.
  7. Tateyama H, Tada T, Hatori H, Murase T, Li W, Eimoto T: Effects of prefixation and fixation times on apoptosis detection by in sigu end-labelling of fragmented DNA. Arch Pathol Lab Med 122: 252-255, 1998.
  8. Thompson CB: Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267: 1456-1462, 1995.
  9. Fernández R, Cotter T : Apoptosis or necrosis: intracellular levels of glutathione influence mode od cell death. Biochem Pharmacol 48: 675-681, 1994.
  10. Bursh W, Oberhammer F, Schulte-Hermann R: Cell death by apoptosis and its protective role against disease. TiPS 13: 245-251, 1992.
  11. Narula J, Haider N, Virmani R y col: Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med 335: 1182-1189, 1996.
  12. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson: Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 119: 493-501, 1992.
  13. Chow SC, Weis M, Kass GEN, Holmstrom TH, Eriksson JE, Orrenius S: Involvement of multiple proteases during fas-mediated apoptosis in T lymphocytes. FEBS Letters 364: 134-138, 1995.
  14. Negoescu A, Lorimer P, Labat-Moleur y col: In situ apoptotic cell labelling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations. J Histochem Cytochem 44: 959-968, 1996.
  15. Steller H: Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267: 1445-1449, 1995.
  16. Nagata S, Colstein P: Fhe fas death factor. Science 267: 1449-1456, 1995.
  17. Olivetti G, Abbi R, Quaini F y col: Apoptosis in the failing human heart. N Engl J Med 336: 1131-1141, 1997.
  18. Mallat Z, Tedgui A, Fontaliran F, Frank R, Durigon M, Fontaine G: Evidence of apoptosis in arrhythmogenic right ventricular dysplasia. N Engl J Med 335: 1190-1196, 1996.
  19. Collucci WS: Apoptosis in the heart. N Engl J Med 335: 1224-1226, 1996.
  20. James TN: Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heart. From postnatal morphogenesis to paroxysmal arrhythmias. Circulation 90: 556-573, 1994.
  21. Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky, Koudelka H, Bukowska K, Bursch W, Schulte-Hermann R: In situ detection of fragmented DNA (tunel assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death: a cautionary note. Hepatology 21: 1465-1468, 1995.
  22. Katz AM: The cardiomyopathy of overload: an unnatural growth response in the hypertrophied heart. Ann Int Med 121: 363-371, 1994.

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Publicación: Diciembre 1998

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